第一部分HCMV感染对细胞周期进程和Cyclins表达的影响 目的：观察HCMV感染对宿主细胞DNA合成及Cyclins表达的影响。 方法：用HCMVAD169毒株感染人胚肺成纤维细胞(HEL)，测定病毒感染性滴度及建立感染性模型。通过接触抑制使细胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分别于感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h终止培养。用流式细胞术测定HCMV感染后细胞周期进程及DNA含量。用WesternBlot法检测CyclinE、CyclinA、CyclinD1蛋白的表达。 结果：HCMV感染细胞后24h～96h，S期细胞明显增多，G2/M期细胞减少，至感染后96h，未发现有G2/M期细胞。感染后24h细胞保持2NDNA含量，全部感染细胞DNA含量在48h内开始升高，感染后72h多数细胞的DNA含量大于2NDNA含量，但未发现有4NDNA含量的细胞。在正常对照细胞DNA含量没有增加。HCMV+PAA组没有检测到DNA含量增加。HCMV感染接触抑制细胞12h时CyclinE蛋白被诱导，感染后24h出现CyclinE峰值；HCMV不能诱导CyclinA蛋白表达；CyclinD1没有被诱导，且在感染后24h开始下降。 结论：HCMV感染同步化于G0/G1期的细胞后，诱导CyclinE蛋白明显升高，激活CyclinE/Cdk2激酶，使细胞周期越过G1/S限制点，将细胞周期阻止于晚G1期。病毒感染未能激活细胞DNA合成，病毒感染后总DNA的增加由病毒DNA复制造成。 第二部分HCMV感染对宿主细胞Cdk2的影响 目的：观察HCMV感染细胞Cdk2的亚细胞定位，研究HCMV感染对Cdk2蛋白水平及对CyclinE/Cdk2激酶活性的影响。 方法：通过接触抑制使细胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percellHCMVAD169毒株感染人胚肺成纤维细胞(HEL)，用免疫细胞化学技术分别测定HCMV感染前及感染后24hCdk2亚细胞定位；Westernblot法测定HCMVCdk2蛋白丰度；用免疫沉淀，激酶活性分析法检测HCMV感染细胞内Cdk2的活性。 结果：接触抑制阻止在G0期细胞Cdk2游离在细胞质，HCMV感染24小时内导致Cdk2从细胞浆移位到细胞核。同时HCMV感染可引起cyclinE/Cdk2激酶的强烈激活，但HCMV感染并不诱导Cdk2蛋白丰度增加。 结论：HCMV感染G0/G1细胞，在24h内导致Cdk2从细胞浆移位到细胞核。使之与细胞核内的调节亚单位CyclinE结合，激活CyclinE/Cdk2激酶。使细胞周期越过G1/S限制点，进展至晚G1期。 第三部分中药金叶败毒制剂对HCMV感染细胞cip1、kip1基因转录和表达的影响 目的:研究中药金叶败毒制剂对HCMV感染细胞的周期调控抑制基因cip1、kip1蛋白表达及cip1mRNA水平的影响，探讨中药金叶败毒制剂体外对HCMV感染的阻断效应及其机制。 方法:通过接触抑制使细胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分别于感染后0h、24h、48h、72h、96h终止培养。采用RT-PCR法及Westernbiot法，分别检测HCMV感染后0h、24h、48h、72h、96h细胞中cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白丰度，检测中药金叶败毒制剂干预后cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白丰度的变化。 结果:病毒感染后0h、24h、48h、72h、96h细胞中cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白丰度均呈下降趋势，而中药金叶败毒制剂及更昔洛韦均可部分阻止这种趋势。更昔洛韦的作用强于中药金叶败毒制剂，但两者间无显著性差异。 结论:中药金叶败毒制剂上调HCMV感染引起cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白丰度的下降，可能是中药金叶败毒制剂抗HCMV效应的作用机制之一。