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研究背景及研究目的:严重创伤、感染、肿瘤切除、骨病等原因所致的骨缺损在临床治疗中非常常见,严重的骨缺损用现有的方法(如自体骨移植、异体骨移植、人工假体等)难以获得满意的疗效。而骨组织工程理论上可以完全再生原有组织,被认为是修复骨缺损理想的方法,在将来的临床中具有广阔的应用前景。骨组织工程是体外将种子细胞种植到可吸收生物支架上后移植到体内修复骨缺损的方法,其中种子细胞是最重要的环节之一。骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,MSCs)被认为是骨组织工程最佳的种子细胞。因为这种细胞不仅在体外增殖能力比成骨细胞强得多;而且具有多向分化潜能,在体内外成骨诱导环境下可分化为骨组织;另外,这种细胞也较容易分离和培养。虽然目前还没有找到MSCs特异的表面标志,但普遍认为MSCs形态呈梭形、贴壁生长、类似纤维细胞但与其功能完全不同;在第一、二代分别约95%、98%细胞的表型一致,为:SH2、SH3、CD29、CD90、CD106等阳性,CD34、CD45、CD14阴性;强阳性表达Stro-1,95%以上CD105表达阳性。应用MSCs作为骨组织工程种子细胞的研究很多,在自体移植修复骨缺损动物模型和异基因移植修复免疫缺陷动物骨缺损模型实验中取得了良好的效果。但MSCs在骨髓中含量很少,并随着年龄的增长减少;现有方法体外迅速扩增困难。因此,自体MSCs的应用会受来源和数量限制,难以满足临床治疗的需要。异基因MSCs来源及数量不受限制,可能作为骨组织工程种子细胞的另一个来源。然而,如果受体不进行免疫抑制治疗,异基因组织、细胞的移植必然会导致免疫排斥反应。这是由供体与宿主DNA多态性位点上不同的等位基因所编码的组织相容性抗原所决定的。另一方面,MSCs虽然表达MHCⅠ类分子和粘附分子ICAM、VCAM、LFA-3;但其只表达极少量的MHCⅡ类分子,不表达B7-1、B7-2和CD40、CD40L。这种特性决定了MSCs较低的免疫原性,可能有利于它的存活。研究表明:小剂量 国家自然科学青年基金资助项目(NO.30300090)国家重点实验室开放课题基金资助项目<WP=13>MSCs可以刺激T淋巴细胞增生;大剂量MSCs则抑制ConA刺激的T淋巴细胞增生以及异基因混合淋巴细胞反应。未分化的MSCs在移植入人和动物体内都显示出了较好的耐受;但其分化后代则被缓慢排斥。有人将转染了BMP2的异基因MSCs作为种子细胞,在修复小鼠股骨骨缺损动物模型中,短期应用免疫抑制剂(FK506)的条件下获得了与自体移植相当的成骨效果。异基因MSCs作为骨组织工程种子细胞,必须首先减轻免疫排斥反应。免疫排斥是异基因器官和组织移植最大的障碍和最难解决的问题,目前还没有任何方法可以诱导特异的、完全的、终身的免疫耐受。在免疫耐受研究中,对CTLA4的研究取得了显著的进展和显示了广阔的前景。CTLA4(Cytotoxic Lymphocyte Antigen 4,CTLA4)是在CTL细胞中发现的第四种特异性抗原基因编码的糖蛋白,它主要表达在活化的T 细胞上。可竞争性抑制APC 膜上的B7分子与T细胞膜上的CD28结合,从而阻断T 细胞的完全活化。CTLA4Ig是由CTLA4胞外区与IgG Fc 段融合而成,具有与CTLA4几乎相同的生物学功能。大量实验证实:CTLA4Ig具有诱导特异性免疫耐受的功能,虽然并不是完全的免疫耐受。因此,我们设想用CTLA4Ig基因转染MSCs,通过细胞表达CTLA4Ig阻断T细胞完全活化所需的辅助信号途径,减轻免疫排斥反应,促进基因修饰MSCs(MSCs-C)及其分化后代在宿主体内的存活。另一方面,MSCs-C要作为种子细胞,必须在体外具有旺盛的增殖能力和保持分化潜能。由于基因修饰后筛选稳定整合的克隆需要多次传代;而MSCs在体外只有20-30PD的生命期和在传代中分化潜能逐渐减弱可能满足不了需要。因此,要对MSCs进行基因修饰并筛选克隆,可能首先应当延长其体外培养生命期并保持分化潜能。人们对端粒酶的研究使这一设想成为可能。研究表明:端粒酶催化亚单位(hTERT)的活性与端粒的长度呈正相关,并在细胞永生化和分化中起重要作用;而且,异位表达hTERT在很多细胞中都可以延长细胞寿命。Simonsen JL等将hTERT转入hMSCs筛选到的hMSCs-T细胞克隆在体外培养200PD以上,细胞未发现明显的衰老现象、保持了多向分化潜能并没有致瘤倾向。这说明用hTERT转染修饰hMSCs可以达到延长hMSCs生命周期、保持多向分化潜能的结果。基于上述认识,本课题拟应用逆转录病毒将hCTLA4Ig基因导入人骨髓间充质干细胞,并筛选获得MSCs-C细胞克隆或细胞群;研究基因修饰MSCs成骨分化潜能和减轻免疫排斥反应情况,观察其作为异基因种子细胞体内成骨能力。从理论上讲,这种细胞既可能保持成骨分化潜能;又可能通过表达CTLA4Ig控制免疫排斥反应。这种特性更有利于MSCs-C的定植,可能对免疫排斥反应不强的异基因MSCs移植是足够<WP=14>的。从而使异基因MSCs-C作为骨组织工程的种子细胞成为可能,为解决骨组织工程种子细胞来源提供一种新的方法,拓宽骨组织工程的应用范围。另外,我们还拟构建hTERT-真核表达载体并转染MSCs以延长其生命期,为将来获得双基因修饰骨髓间充质干细胞克隆:MSCs-T-C细胞克隆奠定基础,争取建立一种骨组织工程标准细胞系。实验方法1、应用XhoI、StuI酶切鉴定pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP重组质粒;Nucleofecto