甜瓜自交系再生与遗传转化体系的研究及蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA克隆

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甜瓜(Cucumis melo L.)作为葫芦科(Cucurbitaceae)植物中的一种重要的园艺作物,是全世界普遍栽培的重要水果,具有较高的商品价值和经济价值。随着植物细胞工程和基因工程技术的迅速发展,应用组织培养、基因转化等技术手段进行甜瓜品质改良、提高抗逆性、创造新种质,已成为甜瓜育种快速有效的新方法。为满足生产需求而进行组织快繁技术,目前多以生产杂交用种和引进品种为材料进行甜瓜组培再生。在转基因方面,通过农杆菌介导的叶盘法对WMV、CMV、TMV病毒外壳蛋白的遗传转化也有成功的报道。由于杂交种的自交分离而难于应用于遗传育种,本试验以3个不同类型的甜瓜低糖自交系为试材,分别研究了再生、转化体系中的主要影响因素:首次尝试了花粉管通道技术在甜瓜遗传转化方面的应用,并建立了相应的早期快速筛选技术;成功克隆了影响果实糖代谢关键酶SPS基因的全长cDNA序列。主要试验结果如下: 1 甜瓜自交系再生过程中主要影响因素的系统研究 本试验以2个甜瓜低糖高代自交系乌克兰(厚皮甜瓜)、鲁薄一号(薄皮甜瓜)为材料,分别研究了获得高质量无菌苗、外植体类型、无菌苗龄及外植体诱导分化、不定芽伸长生根培养基的激素组合等因素效应,分析了6-BA、ZT、KT、2,4-D、GA、NAA、IAA、IBA等常用植物激素对甜瓜自交系再生转化的影响,并通过器官直接发生途径得到甜瓜不定芽。 试验结果表明,甜瓜种子无菌催芽后培养得到的无菌苗质量最高;乌克兰6d日龄、鲁薄一号4d日龄的子叶柄外植体有利于诱导愈伤组织和不定芽,二者适宜的分化培养基分别为MS+1.0mg/L6-BA+3.0-3.5mg/L ZT+0.1 mg/LNAA、MS+2.0-2.5mg/L BA+0.1mg/L NAA,再生频率分别为45%-55%、50%-60%。6-BA、ZT是甜瓜自交系不定芽分化的主要细胞分裂素,ZT更有利于厚皮甜瓜的诱导分化;KT能够诱导甜瓜自交系不定芽的发生,但后期再生植株上部生长点、新叶坏死,生根一般;2,4-D不能诱导不定芽,却诱导了外植体发生不定根:KT、GA激素配比有利于不定芽的伸长生长:IBA是较为理想的甜瓜生根激素。以器官直接发生途径方式产生不定芽与诱导愈伤组织之间有一定的相关性,即只有诱导了高质量的愈伤组织后才能分化不定芽,无愈伤及诱导了膨松白化愈伤组织的外植体不会分化不定芽。不定芽分化存在明显极性现象,子叶柄的近轴端是诱导不定芽的敏感部位。 2 应用根癌农杆菌介导及花粉管通道法实现了3个甜瓜自交系的遗传转化
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