近年来,肿瘤在各种致死性疾病中跃居首位,严重影响着人类的健康。常规治疗肿瘤的方法是放疗和化疗。放化疗具有毒副作用大,预后差,易产生耐药性等缺点,寻找高效低毒的治疗肿瘤的方法成为肿瘤研究的热点。肿瘤分化治疗是使用诱导分化剂使肿瘤细胞分化从而阻止肿瘤的一种手段,它打破了传统认为“一旦成为癌细胞,永远是癌细胞。”的观点。临床研究发现,肿瘤的诱导分化治疗不仅能够克服放化疗肝肾毒性大,使患者耐受性差,降低机体的免疫力等缺点,还能有效的提高患者的生存质量,延长患者的寿命。细胞周围温度是影响肿瘤细胞分化的重要因素,温热具有促进血液循环、增强机体免疫力、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。上世纪七十年代发现,As₂O₃对急性粒性白血病有显著疗效,有效率可达到90%以上。研究发现As₂O₃不仅能够有效的诱导肿瘤细胞分化,而且能够逆转其它诱导分化剂的多药耐药性。一般认为As₂O₃的诱导分化机制可能与降解PML-RARα融合蛋白、恢复维甲酸信号通路、抑制JAK-STAT信号通路有关,忽略了As₂O₃从中药药性上为大热性药物的实质。中药热性药物能够激发细胞能量代谢、营造机体“温阳”环境。本课题以白血病为研究对象、以As₂O₃的中药热性为基础,探究其营造的温热微环境在诱导白血病细胞分化中的机制,并用川乌水煎液营造的温热微环境和自然温热微环境佐证,为肿瘤诱导分化治疗提供新思路。本研究从体外,体内,机制三个方面,评价温热微环境对白血病细胞增殖、能量代谢、自我更新、分化、自噬和衰老的影响。首先,用CD34⁺/CD38^-抗体包被过的磁珠分离器将白血病细胞分离得到白血病非干细胞（K562）和白血病干细胞（K562s）。流式细胞仪检测分离出的两种细胞的干性标记Nanog和Oct₄的表达,软琼脂克隆形成实验检测自我更新能力。用As₂O₃处理两种细胞后,Brdu掺入法检测对增殖的影响,筛选出无毒的As₂O₃浓度。ATP试剂盒检测能量产生、氧电极检测耗氧量、温度探针检测培养基温度的变化,确定As₂O₃创造了温热微环境。甲基纤维素细胞成球实验检测自我更新能力、联苯胺法检测红系分化、Western blot法检测红系分化标志物γ-globin和CD235a的表达。为了进一步证明温热微环境对白血病的诱导分化作用,我们也在川乌水煎液营造的温热微环境和自然温热环境下观察了白血病细胞的分化,ATP试剂盒检测能量产生、氧电极检测耗氧量、温度探针检测培养基温度的变化,确定川乌水煎液创造了温热微环境。Brdu掺入法检测增殖、甲基纤维素细胞成球实验检测自我更新能力、联苯胺法检测红系分化、Western blot法检测干性标志Nanog、Oct₄和红系分化标志γ-globin、CD235a。接着,建立裸鼠K562和细胞皮下移植瘤模型,评价As₂O₃对荷瘤小鼠皮下移植瘤的诱导分化作用。记录荷瘤小鼠的存活率;测量小鼠体温确定As₂O₃在体内创造了温热微环境;测量瘤体积评价As₂O₃对肿瘤生长的影响;测自主活动评价As₂O₃对小鼠生存状态的影响;Elisa法检测荷瘤小鼠血浆凝血因子水平;血流变检测血浆粘度;血细胞分析仪检测血中红细胞数、白细胞数;Western blot检测红系分化标志γ-globin;免疫组化检测红系分化标志CD235a。为了进一步证明药物创造的温热微环境在体内对白血病细胞的诱导分化作用,我们用川乌水煎液治疗荷瘤小鼠,通过小鼠存活率、体温、肿瘤体积、自主活动、红白细胞数、凝血因子、血浆粘度和腋下瘤分化,观察其创造的温热微环境是否与As₂O₃有相似的作用。最后,我们探索温热微环境诱导白血病细胞分化的机制。体外研究,用As₂O₃处理两种分类后的白血病细胞,AO染色法检测自噬、细胞免疫荧光法检测自噬相关的LC3-B和P62蛋白表达、SA-β-gal染色法检测细胞衰老、免疫组化法检测衰老标志物P16INK4a表达。我们在川乌水煎液营造的温热微环境和自然温热环境下对白血病细胞的分化机制进行了验证,AO法检测自噬,SA-β-gal染色法检测细胞衰老,免疫组化法检测衰老标志物P16INK4a的表达。体内研究,评价As₂O₃对荷瘤小鼠瘤组织的自噬和衰老的影响,免疫组化法检测自噬相关蛋白P62和衰老标志P16INK4a。为了进一步佐证温热微环境对白血病的诱导分化机制,我们用川乌水煎液治疗荷瘤小鼠,通过AO法检测自噬,免疫组化法检测衰老标志P16INK4a,观察其创造的温热微环境是否与As₂O₃有相似的作用。体外研究,流式细胞术表明K562s细胞的干细胞标志物Nanog、Oct₄明显高于K562细胞,软琼脂克隆形成实验表明K562s细胞比K562细胞具有更强的自我更新能力。BrdU掺入法实验结果显示,0.5 uM的As₂O₃无细胞毒性。ATP、耗氧量、温度检测表明,0.5uM的As₂O₃使细胞耗氧量增加、使ATP减少,稍微升高培养基的温度,能够创造温热微环境。甲基纤维素细胞成球实验表明,0.5uM的As₂O₃显著抑制K562和K562s细胞的自我更新能力。联苯胺染色法显示,0.5uM的As₂O₃显著的促进K562s细胞分化,对K562细胞没有分化作用。Western blot结果显示,0.5uM的As₂O₃显著促进K562s细胞的红系分化标记γ-globin和CD235a的表达,但对K562细胞无影响。川乌水煎液创造的温热微环境和自然温热环境对两种分类后的白血病细胞产生与As₂O₃温热微环境相似的结果。体内研究,2mg/kg的As₂O₃组使小鼠的存活率高,状态好,肿瘤得到控制,体温稍微升高,血浆中凝血因子表达降低,血浆粘度下降,血中红细胞数增多,白细胞数减少。Western blot显示As₂O₃显著促进K562s细胞皮下移植瘤的γ-globin的表达。川乌水煎液对荷瘤小鼠产生与2mg/kg As₂O₃相似的作用。机制研究表明,体外0.5uM的As₂O₃能显著的促进K562细胞自噬,使其直接衰老;而对K562s细胞抑制自噬,诱导其分化衰老。体内2mg/kg As₂O₃也能够显著促进K562s细胞皮下移植瘤分化走向衰老,使K562细胞皮下移植瘤直接走向衰老。川乌水煎液验证了As₂O₃温热微环境诱导白血病细胞分化的机制。综上所述,药物温热微环境能够诱导白血病细胞分化,其机制是在不杀伤肿瘤细胞的情况下改变K562细胞和K562s细胞的自噬状态、诱导K562s细胞分化衰老、同时使K562直接衰老,从而阻止肿瘤。