枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)是能形成芽胞的革兰氏阳性模式细菌,其广泛分布于不同环境中。不同枯草芽胞杆菌菌株可以产生各种特异的活性物质。这些活性物质赋予枯草芽胞杆菌对植物抗病和促生能力。因此,其通常被认为是一种植物友好型细菌,并且作为生物肥料和农药使用多年。在实验室条件下,枯草芽胞杆菌依赖其产生的活性物质,具有较好的抑制病原菌的能力。但在实际田间应用中,效果往往不够稳定。枯草芽胞杆菌抗病和促生效力的发挥需要其稳定地定植(colonization)于植物。在前期,本课题组从魔芋愈伤组织中分离得到一株内生枯草芽胞杆菌,命名为BSn5。该菌株对数生长末期产生一种对革兰氏阳性菌有抑制活性的物质。通过对BSn5菌株全基因组测序和分析,发现一个潜在的羊毛硫细菌素合成基因簇和一个假定的抗生素类合成基因簇为该菌株所特有。本论文分别针对这两者开展了一些研究工作。前期通过基因敲除及活性检测,最终确定潜在羊毛硫细菌素基因簇的功能为合成subtilomycin。进一步发现subtilomycin生物合成基因簇位于枯草芽胞杆菌基因组的重组热点。调查不同环境来源的枯草芽胞杆菌产生subtilomycin的情况,发现subtilomycin产物与植物来源具有相关性。因此,推测subtilomycin与枯草芽胞杆菌在植物中定植有关。本论文第一部分的研究依据此推测开展实验。首先开展了植物根粗提液对BSn5产subtilomycin影响的实验,发现魔芋、拟南芥、大豆、番茄根提取液可以促进BSn5产subtilomycin,提高了 10%-43%。进一步以植物源多糖以及单糖和二糖进行实验,发现存在于植物细胞壁中的葡甘聚糖、阿拉伯半乳聚糖、木聚糖以及果胶能够促进BSn5产subtilomycin,而淀粉、单糖和二糖不能促进subtilomycin的产生。因此,植物源多糖可以促进BSn5产subtilomycin。其次,开展了 BSn5野生型以及subtilomycin合成基因突变体在植物中定植的实验。发现在大豆、番茄以及拟南芥中,野生型菌株在植物根表面定植能力强于突变体。因此,subtilomycin的产生有利于产生菌在植物中定植。同时发现,接种野生型菌株的植株根重与株高分别显著大于接种突变体的植株。在青枯菌存在的情况下,接种野生型菌株的植株存活率高于接种subtilomycin突变体的植株。因此,产subtilomycin的菌株在植物中有更强的定植能力,并有利于植物生长以及抗病。最后,我们检测了 subtilomycin对生物被膜(biofilm)形成的影响。发现野生型比subtilomycin突变体能形成更强健的生物被膜。同时,体外添加4μg/mL subtilomycin突变体能够恢复一定的表型。死细胞荧光染色法观察生物被膜,发现subtilomycin可能通过影响细菌特异死亡,使生物被膜形成类似“褶皱”的结构,从而形成更强的生物被膜。进一步利用subtilomycin C端包含5个硫醚环的酶解产物开展以上实验,发现该片段就足以起到和subtilomycin 一样的促进生物膜形成的效果。因此,subtilomycin促进生物膜的形成不依赖于其抑菌活性,而和硫醚环结构相关。另外,在寻找BSn5活性物质阶段,我还开展另一个潜在抗生素合成基因簇的功能验证。通过对含有抗生素合成酶保守结构域的关键基因orf1和orf8在转录水平的检测,验证了该基因簇是表达的。通过对这两个基因的中断敲除,获得了突变体菌株。利用这些菌株开展了抑菌活性和基于液相质谱的非目标代谢组差异分析,结果发现,虽然在所选指示菌中,未找到野生型和突变体之间的活性差异;但通过代谢组差异分析,找到了两个可能的分子量,分别为627.2858和829.381。对于找到的存在差异的化合物将在后续开展抑菌活性、分离纯化和异源表达等实验工作进一步加以确证。我们的研究首次提出一种特定的羊毛硫细菌素subtilomycin的产生能够受到植物源多糖的诱导,进一步发现其能影响生物被膜的形成和影响植物定植能力。本研究有助于理解枯草芽胞杆菌的定植机制和对进一步开发稳定、有效的生物农药和生物化肥具有指导意义。