恶性肿瘤致死率高,是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。目前,临床上主要采用的非手术治疗手段有化学治疗、放射治疗等,但这些手段在治疗肿瘤的同时也使患者的免疫功能受到严重破坏。因此,寻找能够在肿瘤治疗中提高机体免疫功能的免疫调节剂具有重大的社会和经济意义。胸腺五肽(Thymopentin, TP5)和胸腺素α1(Thymosin, Tα1)是从胸腺中获得的两种多肽,二者具有相似的免疫调节活性,是重要的免疫调节剂,已成功用于临床肿瘤辅助治疗,能提高化疗或放疗病人的免疫应答及耐受性,抑制或降低病情的进展或复发,延长病人的生存期,提高病人的生活质量。但是,TP5的体内半衰期(t1/2)很短,人体内药代学研究发现TP5的t1/2只有30s。需要频繁的给药才能维持疗效。Tα1l的体内t1/2较长(约为100min),但目前主要以化学合成的方法生产,价格昂贵,难以被广大患者所接受。为了提高TP5的活性,延长其体内t1/2,本课题组已将具有相似生物活性与临床用途的TP5和Tα1借助基因工程方法连接在了一起,在毕赤酵母Pichia pastoris中表达制备了融合肽Tα1-TP5。研究证实Tα1l-TP5具有比TP5更强的体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖及体内促进巨噬细胞吞噬的能力,Tα1-TP5也具有比TP5及Tα1更长的体外血浆t1/2。但是,Tα1-TP5经Pichia pastoris分泌表达的量很少,无法满足进一步体内试验研究的需求,并且需要凝血酶切割去掉融合标签,纯化成本高,纯化步骤繁琐。切割后,Tα1-TP5的N端带有2个多余的氨基酸残基,C端带有多余的4个氨基酸残基,可能存在免疫原性。故为了提高产量并降低纯化成本,本课题换用大肠杆菌表达体系,采用内含肽介导的纯化系统,加入二硫苏糖醇(DTT)诱导内含肽自切割,分别从细菌裂解上清及包涵体中纯化Tα1-TP5。考察Tα1-TP5是否具有比TP5及Tαl更强的体内免疫调节活性及辅助抗肿瘤作用,并进一步采用表面等离子共振技术(SPR)研究Tal-TP5与Toll样受体2(TLR2)的结合情况,为将Tα1-TP5开发成一种新型的免疫调节剂提供重要的基础与依据。本课题的研究内容及取得的主要成果有以下几个方面。1Ta1-TP5在大肠杆菌中的表达及纯化采用大肠杆菌表达系统对Tα1-TP5进行了融合表达。选用pTYB2作为表达载体,将Tα1-TP5基因插入至内含肽(Sce intein)基因的N端,Sce intein基因的C端与几丁质结合域(Chitin binding domain, CBD)相连,构建重组质粒pTYB2-Tal-TP5-Sce intein-CBD,转入E.coli ER2566中诱导表达重组蛋白。超声裂解菌体后SDS-PAGE考察重组蛋白的可溶表达情况。考察不同诱导温度及诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度对重组蛋白可溶表达量的影响。采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,加入DTT诱导intein柱上自切割,从而释放Tα1-TP5。为了提高Tα1-TP5的产量,也从包涵体中纯化了Tα1-TP5。摸索了包涵体的洗涤条件,采用直接稀释法对包涵体蛋白Tα1-TP5-Sce intein-CBD进行复性,并考察还原剂和氧化剂的比例、L-精氨酸(L-Arg)及最终尿素的浓度对复性效率的影响。复性后的蛋白过亲和层析柱,加入DTT诱导intein柱上自切割,从而获得Tα1-TP5。Tα1-TP5进一步经Superdex30(?)钝化并脱盐后,ESI-MS鉴定其分子量的正确性。Tricine-SDS-PAGE鉴定Tα1-TP5的纯度。结果显示,Tα1-TP5成功在E.coli ER2566中表达,融合蛋白部分以包涵体的形式存在,诱导温度由37℃降低至16℃时可使可溶蛋白的表达量由原来的15.9%增加至18.9%,而IPTG浓度由1mmol/L降至0.1mmol/L对可溶蛋白表达量影响不大。复性体系中还原剂和氧化剂的比例为1：22.5、尿素终浓度为0.8mol/L时复性效率最高。L-Arg的加入对复性效率影响不大。Superdex30进一步纯化和脱盐后,从菌体裂解上清中获得了约4.6mg Tα1-TP5,从包涵体中获得了约3.0mg Tα1-TP5。 ESI-MS分别鉴定分子量,发现与理论值相当(3785.02Da), Tricine-SDS-PAGE检测Tal-TP5的纯度大于95%。最终我们运用此方法从每L发酵液中得到了约7.6mgTal-TP5。2Tal-TP5体内外免疫调节活性研究采用CCK-8法测定了Tal-TP5对小鼠脾淋巴细胞增殖的促进作用,采用流式细胞术考察了Tα1-TP5对小鼠脾淋巴细胞表面CD69分子表达的促进作用,采用RT-PCR技术检测Tα1-TP5对小鼠脾淋巴细胞IFN-y表达的的影响。结果表明：从上清及包涵体中纯化的Tα1-TP5均能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,且作用呈浓度依赖性,浓度为40μg/mL时,增殖率分别为26.21%、21.84%,与阴性组比较差异具有显著性意义(p<0.01,p<0.01)。Tα1-TP5能促进CD69的表达,与阴性对照组比较差异具有显著性意义(21.51%vs.9.5%,p<0.05),Tα1-TP5促进淋巴细胞表面CD69表达的能力也较TP5(16.06%)和Tα1(16.65%)高。RT-PCR结果显示Tα1-TP5能在基因水平上促进IFN-y的表达,且促进IFN-y表达的能力高于TP5及Tα1。说明我们纯化的Tα1-TP5具有比TP5及Tα1更强的免疫调节活性。连续2天腹腔注射剂量为250mg/kg氢化可的松(HC),建立小鼠体内免疫抑制模型,皮下注射Tα1-TP5连续治疗2周,考察Tα1-TP5对小鼠免疫抑制的抵抗作用。结果发现,Tα1-TP5能明显增强免疫抑制小鼠的胸腺指数,与模型组比较差异具有显著性意义(2.253±0.427vs.0.444±0.407,p<0.05),与TP5及Tα1单独给药组比较差异也具有显著性意义(p<0.05)。但Tα1-TP5X(?)脾脏指数的影响不大。HE染色分析Tα1-TP5能改善HC导致的胸腺萎缩,增加胸腺组织中胸腺细胞的数量。另外Tα1-TP5能使CD4+CD8+胸腺细胞的比例恢复至正常水平。与模型组比较,Tα1-TP5显著增加外周血中IFN-γ的含量,抵抗HC造成的IFN-γ水平降低。总之,Tα1-TP5具有改善HC诱导的免疫抑制状态的能力,且活性比TP5及Tα1l更强。3Tal-TP5辅助抗肿瘤作用研究采用CCK-8法测定了Tal-TP5(?)(?)乳腺癌细胞MDA-MB-231、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549及黑色素瘤细胞B16四种肿瘤细胞增殖的抑制作用,结果表明：Tα1-TP5对四种肿瘤细胞生长的抑制作用呈时间依赖性,对MDA-MB-231细胞的抑制作用最强,72h时细胞活力只占阴性组的64.6%,显著高于TP5组(64.6%vs.90.8%,p<0.05),但是与Tαl组比较没有显著性差异(64.6%vs.70.2%,p>0.05)。Tα1-TP5对HepG2细胞和A549细胞的抑制作用稍弱于对MDA-MB-231细胞,72h时细胞活力分别占阴性组的73.9%及69.9%,抑制作用强于TP5但与Tα1差别不大。Tα1-TP5对B16细胞也有一定的抑制作用,72h时细胞活力只占阴性组的82.5%,抑制作用与TP5及Tα1相比没有显著性差异。建立C57BL/6小鼠荷黑色素瘤模型,考察Tα1-TP5联合环磷酰胺(CY)对肿瘤生长的抑制作用。结果表明：与CY单独给药相比,Tα1-TP5联合CY明显降低肿瘤体积及肿瘤重量,药物治疗2周后肿瘤重量减少了将近88.1%。Tα1-TP5也能逆转CY导致的外周血中白细胞数量减少,治疗2周后外周血中白细胞数量增加至正常水平。流式细胞术检测肿瘤组织中组织相容性复合体I(MHC I)的表达,发现CY组MHC I的表达率只有11.65%,而Tα1-TP5能显著增加肿瘤组织中MHC I的表达,与CY组比较差异具有显著性(28.71%vs.11.65%,p<0.05)。免疫组化结果显示Tα1-TP5较TP5及Tα1更能促进肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润及CD86的表达。可见Tα1-TP5具有弱的直接杀伤B16细胞的功能,主要通过激活免疫系统而发挥辅助抗肿瘤作用。4Tα1-TP5与TLR2结合活性研究采用激光共聚焦显微镜观察考察Tα1-TP5与骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)的结合情况。将Tα1-TP5、TP5及Tα1分别用异硫氰酸荧光素(FITC)标记,并分别与分离的BMDMs孵育2h,再用Hoechst33342及DiI分别标记细胞核及细胞膜,激光共聚焦显微镜观察药物结合情况。结果发现,Tα1-TP5、P5及Tα1均能结合在BMDMs的细胞膜上。采用SPR技术检测Tα1-TP5与存在于BMDMs上的TLR2(?)的结合。将TLR2作为配体以氨基偶联的方式偶联到CM5芯片上,Tα1-TP5、TP5及Tα1作为待分析物流过芯片表面,考察三种多肽与TLR2的结合能力及亲和力大小。结果显示：SPR技术能够准确反映三种多肽与TLR2(?)的结合水平。Tα1-TP5、TP5及Tα1与TLR2的解离平衡常数(KD)分别为6.84×10-6mol/L、1.57×10-6mol/L及35.4×10-6mol/L。 Tα1-TP5与TLR2的结合能力显著强于Tα1,但与TP5相比没有显著性差异。到目前为止,三种多肽可能的受体首次被确定。本研究取得的主要成果和结论如下：(1)首次构建了表达Tα1-TP5的大肠杆菌表达系统,对重组蛋白质成功进行了表达,并利用内含肽介导的纯化系统分别从细菌裂解上清及包涵体中分离纯化了Tα1-TP5, Superdex30进一步纯化得到了高纯度的目的多肽。获得的Tal-TP5C(?)(?)只含有一个多余的甘氨酸(Gly)残基。此研究提供了一种高效率、低成本的纯化策略,适合Tα1-TP5的大规模生产。(2)纯化的Tα1-TP5能明显促进小鼠脾淋巴细胞的增殖、CD69及IFN-γ的表达,展示了较好的体外免疫调节活性。(3)首次进行了Tα1-TP5的体内免疫调节活性研究。Tα1-TP5能抵抗HC诱导的免疫抑制,且效果较TP5及Tα1强。(4)首次进行了Tα1-TP5的辅助抗肿瘤作用研究。Tα1-TP5联合CY展现了很好的抗肿瘤活性,同时Tα1-TP5激活了被CY抑制的免疫系统,增强对肿瘤的杀伤。Tα1-TP5(?)的辅助抗肿瘤活性较TP5及Tα1强。(5)首次研究了Tα1-TP5的受体,Tal-TP5能与TLR2结合,提示Tα1-TP5介导免疫应答可能是通过TLR2信号通路。