1、研究背景结直肠癌是威胁人类健康的重要因素之一,其发生率及死亡率在恶性肿瘤中排前几位。现在,手术治疗和放化疗治疗是结直肠癌的临床治疗的主要手段。然而由于肿瘤组织中干细胞的存在,使得肿瘤治疗的效果大打折扣。越来越多的研究表明,肿瘤干细胞是化疗抵抗和肿瘤复发的罪魁祸首。许多临床试验结果显示,阿司匹林具有降低肿瘤发病率和死亡率的作用,特别是在结直肠癌中的防治效果最为突出。在之前的多数研究中,都认为阿司匹林的抗癌活性是通过抑制增殖、诱导凋亡来实现的,在最近一些研究中显示阿司匹林可以有效的抑制某些肿瘤细胞的干性。但是阿司匹林对于结直肠癌干细胞的作用目前尚无报道。本研究旨在探究阿司匹林在结直肠癌中对于肿瘤干细胞的影响。2、研究方法本研究应用结直肠癌细胞系HCT116,LoVo及RKO细胞系进行研究。(1)①通过CCK8实验检测细胞增殖和活性,得出阿司匹林对三种不同细胞系的抑制能力;②通过平板克隆形成实验,比较阿司匹林的处理对结直肠癌细胞平板克隆形成率的影响。(2)①通过体外微球悬浮培养,比较阿司匹林处理对微球直径和微球数目的影响;②通过流式细胞术,比较阿司匹林长期处理对结直肠癌细胞的ALDH1+阳性群体比例的影响。(3)通过western blot检测经阿司匹林处理后,“干性”相关因子蛋白表达的变化情况。(4)通过体内皮下成瘤模型,检测阿司匹林在体内条件下对于结直肠癌的作用影响:①将接种HCT116后的BALB/C(nu/nu)裸鼠分为两组,阿司匹林灌胃方式给药3周后,比较阿司匹林对瘤重和瘤体积的影响;②提取所成肿瘤组织的肿瘤细胞,进行原代培养后,进行体外微球培养,比较口服阿司匹林对微球形成能力(微球数目、直径)的影响;③收集裸鼠成瘤肿瘤组织,提取总蛋白,采用western blot方法检测调控细胞自我更新基因的蛋白表达水平。(5)通过western blot和RT-qPCR方法,检测阿司匹林对于干性因子Nanog分别在转录水平和翻译水平的影响。3、研究结果(1)阿司匹林抑制结直肠癌细胞的增殖①运用CCK8实验测定结直肠癌细胞系HCT116、LoVo和RKO在阿司匹林处理120h后的细胞活性并计算IC50值,阿司匹林处理后细胞活性下降且呈时间和浓度依赖性;②阿司匹林处理后的平板克隆形成的数目明显的下降,可以证明阿司匹林可以抑制细胞的生长活性及降低独立生存的能力。(2)阿司匹林抑制结直肠癌的“干性”特征①体外微球悬浮培养实验证明了,阿司匹林可降低微球形成能力(微球的直径变小、微球的数目减少)并且呈浓度依赖性下降,差别有统计学意义;②运用流式细胞术检测结直肠癌细胞的ALDH1的阳性群体所占的比例,证明低剂量、长时间的使用阿司匹林处理结直肠癌细胞,可明显降低其ALDH1的阳性群体比例,差别具有统计学意义。(3)阿司匹林降低“干性”相关因子的表达应用western blot检测一些参与细胞自我更新相关基因调控的蛋白的表达水平,证明阿司匹林可以降低一些“干性”相关因子的表达,且具有时间和浓度依赖性。(4)阿司匹林可在体内条件下抑制结直肠癌的增殖①应用皮下成瘤模型,将结直肠癌细胞系HCT116接种到BALB/C(nu/nu)裸鼠皮下,五天后给予阿司匹林灌胃给药处理,经过三周的给药处理后,测得阿司匹林处理组所形成的皮下肿瘤明显小于对照组的皮下肿瘤大小;裸鼠处死后取下肿瘤组织,对其进行称重测量,发现阿司匹林处理组的瘤重明显小于对照组的瘤重,以上差异均具有统计学意义;②取下形成的皮下肿瘤,并将肿瘤组织细胞进行原代培养,进行微球悬浮培养实验,发现阿司匹林处理组肿瘤组织得到的原代细胞的微球形成能力低于对照组,差异具有统计学意义;③提取肿瘤组织中的总蛋白,利用western blot的方法检测多种“干性”相关因子的蛋白表达,发现阿司匹林处理组的肿瘤组织其“干性”相关因子的表达量明显低于对照组。(5)阿司匹林抑制关键“干性”因子Nanog的表达①分别用western blot和RT-qPCR检测阿司匹林对Nanog蛋白水平和转录水平的影响,发现阿司匹林可以明显的降低Nanog的蛋白水平,但对mRNA水平无明显影响;②将阿司匹林与蛋白合成抑制剂放线菌素酮(CHX)联用,发现阿司匹林可以缩短Nanog蛋白的半衰期;③阿司匹林与蛋白酶体抑制剂MG132合用后,仍然不能逆转阿司匹林对Nanog的抑制作用。4、研究结论(1)阿司匹林可以抑制结直肠癌的增殖;(2)阿司匹林可以抑制结直肠癌“干性”的特征;(3)阿司匹林抑制“干性”相关因子的表达;(4)阿司匹林在体内模型中仍能抑制结直肠癌的增殖和“干性”;(5)阿司匹林在蛋白水平上抑制关键“干性”因子Nanog的表达。