研究目的: 1.了解阻断PI3K/Akt通路对结肠癌细胞的生长、凋亡、细胞周期、对化疗药物的敏感性的影响； 2.了解抗EGFR单克隆抗体对结肠癌细胞生长、凋亡、细胞周期、以及对化疗药物的敏感性的影响； 3.分别从蛋白水平和基因水平检测抗EGFR单抗对Lovo细胞内PI3K/Akt及其下游信号通路的影响，从而探讨抗EGFR单抗影响肿瘤细胞化疗敏感性的可能机制。 研究方法: 1.阻断PI3K/Akt通路对人结肠癌细胞株化疗敏感性影响 （1）了解单药LY294002对Lovo细胞的生长抑制作用 人结肠癌细胞Lovo体外培养、传代，分别用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002作用24、48、72小时，MTT法检测细胞生长抑制率； （2）了解LY294002与化疗药物联合对Lovo细胞的生长抑制作用 常规培养Lovo细胞，实验时将细胞分为7组，分别为对照组、CPT-11单药组、L-OHP单药组、5-Fu单药组、CPT-11联合组、L-OHP联合组、5-Fu联合组。单药化疗组均设6个不同的浓度组：CPT-11为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml：L-OHP为1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml：5-Fu为0.5、1、2、4、8、16μg/ml。各联合组除加入同样浓度的化疗药外，还加入LY294002，其浓度固定为10μM。对照组不加任何药物。加药后分别作用24、48、72小时，MTT法检测细胞生长抑制率，金正均法判断两药合用是否具有协同作用。 （3）了解LY294002与化疗药物联合对Lovo细胞的凋亡诱导作用和对细胞周期的影响 将细胞分为7组，分别为对照组、CPT-11单药组、L-OHP单药组、5-Fu单药组、CPT-11联合组、L-OHP联合组、5-Fu联合组。单药组的给药浓度分别为CPT-11（20μg/ml）、5-Fu（1.0μg/ml）、L-OHP（2μg/ml），各联合组中化疗药物的浓度与单药组相同，LY294002的给药浓度固定为10μM，对照组不加任何药物。加药后培养48小时，AnnexinⅤ-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况，PI单染法、流式细胞仪进行细胞周期检测和分析。 2.抗EGFR单抗对人结肠癌细胞化疗敏感性的影响研究 （1）了解人结肠癌细胞Lovo的细胞学特性 台盼兰拒染活细胞计数法测定细胞生长情况，绘制生长曲线；免疫组化法和流式细胞术分别检测Lovo细胞表面EGFR的表达情况。 （2）了解抗EGFR单抗对人结肠癌细胞的生长抑制作用 ①抗EGFR单抗对Lovo细胞的生长抑制作用 常规培养人结肠癌细胞Lovo，实验时将细胞分为C-225组和h-R3组，二组细胞的给药浓度均分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。加药后分别培养24、48、72小时，MTT法检测细胞生长抑制率。 ②EGFR单抗对Lovo细胞的凋亡诱导作用和对细胞周期的影响 细胞分组同上，加药后分别培养24、48、72小时，AnnexinⅤ-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 进行细胞周期检测时，细胞分为空白对照组、h-R3组和C-225组，h-R3组加入终浓度为50μg/ml的尼妥珠单抗，C-225组加入终浓度为200μg/ml的西妥昔单抗，对照组不加药物。加药后作用48小时，PI单染法、流式细胞仪进行细胞周期检测和分析。 （3）了解抗EGFR单抗对人结肠癌细胞化疗敏感性的影响 ①了解抗EGFR单抗联合化疗对Lovo细胞的生长抑制作用 将细胞分为9组，分别为CPT-11组、CPT-11+C-225组、CPT-11+h-R3组、5-Fu组、5-Fu+C-225组、5-Fu+ h-R3、L-OHP组、L-OHP+C-225组、L-OHP+ h-R3组。单药化疗组均设6个不同的浓度组：CPT-11为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml； L-OHP为1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml：5-Fu为0.5、1、2、4、8、16μg/ml。各联合组中，C-225给药浓度固定为200μg/ml，h-R3浓度固定为50μg/ml，化疗药的浓度梯度设定同单药组。加药后分别培养24、48、72小时，MTT法检测细胞生长抑制率。 ②了解抗EGFR单抗联合化疗对Lovo细胞的凋亡诱导作用和对细胞周期的影响 将细胞分为10组，分别为对照组、CPT-11单药组、CPT-11+C-225组、CPT-11+h-R3组、L-OHP单药组、L-OHP+C-225组、L-OHP+ h-R3组、5-Fu单药组、5-Fu+C-225组、5-Fu+h-R3组。单药组的给药浓度分别为CPT-11（20μg/ml）、5-Fu（1.0μg/ml）、L-OHP（2μg/ml）；各联合组中化疗药物的给药浓度与单药组相同，C-225的给药浓度固定为200μg/ml，h-R3的给药浓度固定为50μg/ml；对照组不加任何药物。加药后培养48小时，AnnexinⅤ-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况，PI单染法、流式细胞仪进行细胞周期检测和分析。 3.抗EGFR单抗对PI3K/Akt通路的影响研究 （1）蛋白水平 Western-blting法检测抗EGFR单抗处理后细胞及对照组细胞内PI3K、Akt、磷酸化Akt、c-Raf. GSK-3 B、磷酸化GSK-3β、PTEN等蛋白的表达情况。 （2）基因水平 实时荧光定量PCR法检测细胞内PI3K、Akt、Raf-1、GSK-3β、PTEN基因的表达情况。 4.统计学方法实验结果以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较时，若只有一种影响因素则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；两种因素以上则采用析因分析，有交互效应时采用LSD法进行多重比较，无交互效应时，每种因素可采用单因素方差分析，多重比较若方差齐采用LSD法，方差不齐时采用近似F检验（Welch方法）及多重比较的Dunnett’s T3方法。两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05（双侧）表示差异有显著性。 研究结果: 1.阻断PI3K/Akt通路对人结肠癌细胞株化疗敏感性影响 （1）单药LY294002对Lovo细胞的生长抑制作用 经不同浓度的LY294002处理后，Lovo细胞的生长抑制率随着给药浓度的增加和作用时间的延长而提高，提示LY294002对Lovo细胞有较明显的生长抑制作用，且这种作用有明显的时间依赖性和剂量依赖性。 （2）LY294002与化疗药物联合对Lovo细胞的生长抑制作用 CPT-11、5-Fu、L-OHP在各个时间段均对Lovo细胞均有较明显的生长抑制作用，并呈剂量依赖性作用和时间依赖性。另外，单纯化疗与化疗联合LY294002相比，联合组的细胞生长抑制作用显著强于单药化疗组。金正均法计算显示，无论作用时间如何，LY294002与CPT-11、5-Fu、L-OHP均具有协同作用（q>1.15），提示LY294002可以增强化疗药物对Lovo细胞的生长抑制作用。 （3）LY294002与化疗药物联合对Lovo细胞的凋亡诱导作用和对细胞周期的影响 与对照组相比，三种化疗药单药作用或与LY294002联合时，Lovo细胞的凋亡率均有所升高。 2.抗EGFR单抗对人结肠癌细胞化疗敏感性的影响研究 3.抗EGFR单抗对PI3K/Akt通路的影响研究 结论: 1.特异性PI3K（p110）抑制剂与化疗药物联用时，可明显提高Lovo细胞对化疗药物的敏感性、增加肿瘤细胞的凋亡率，并增强化疗药物对肿瘤细胞的G2/M期阻滞作用； 2.单药西妥昔单抗对Lovo细胞有明显的生长抑制和凋亡诱导作用，而尼妥珠单抗单药处理时对Lovo细胞的生长仅有微弱的抑制作用；二者对Lovo细胞均有G0/G1期阻滞作用； 3.两种抗EGFR单抗与化疗药物联合时对细胞的影响不同，C-225与伊立替康和奥沙利铂具有协同作用，而与氟脲嘧啶则呈相互拮抗作用；h-R3与这三种药物则都呈协同或相加作用：C-225和h-R3与化疗药物联用时均可增强化疗药物G2/M期阻滞作用； 4.两种抗EGFR单抗都能够抑制结肠癌细胞内的PI3K/Akt信号传导通路，结合第一部分实验结果，我们考虑这可能是抗EGFR单抗提高化疗药物敏感性的原因之一；另外，这两种药物对细胞内EGFR的下游信号传导通路的影响也有不同之处，C-225可以轻度抑制Raf激酶的活性、而h-R3则没有这种作用；而h-R3可以通过增强PTEN的表达对PI3K/Akt信号通路进行负性调控、但C-225则不能，我们考虑这种现象可能与两种单抗与EGFR结合的表位不同有关。