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近年来转基因产品非法种植和意外污染等事件不断增加，急需加强对转基因产品的检测和监管。由于涉及非法种植和国际贸易的转基因作物体量巨大，建立简单、快速和低成本的转基因产品“田间地头”现场检测方法，是实现转基因产品快速检测和标识管理的关键。基于外源蛋白分析的转基因检测技术，具有前处理容易、操作简单、无需精密仪器和成本低廉等突出优势，非常适合转基因成分的现场快速筛查，近些年受到了越来越多的关注。主要的外源蛋白分析方法，包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫印迹法和免疫层析试纸条等方法，多采用比色法检测，分析灵敏度不足。最近发展的荧光免疫分析、化学发光免疫分析、免疫聚合酶链式反应(PCR)分析等可以实现外源蛋白高灵敏分析，然而仍无法实现转基因现场即时(POCT)定量分析，不能满足基于低阈值的转基因标识制度管理的要求。
免疫传感器容易实现微型化和集成化，为外源蛋白现场定量分析提供了一个可行的技术方案。本文基于纳米材料作为固相载体和信号探针载体开发免疫传感新方法以提高外源蛋白分析灵敏度，实现简单、快速、POCT定量分析。研究内容分为三个部分，具体如下：
(1)高灵敏免标记电致化学发光免疫传感器用于转基因作物中外源蛋白PAT/bar定量分析
本文利用打印机碳粉通过简易方法合成新型碳球纳米粒子(CNPs)，基于该纳米材料作为抗体载体和高效电极材料首次构建了免标记电致化学发光(ECL)免疫传感器，用于转基因油菜中外源蛋白PAT/bar高灵敏分析。在本研究中，将CNPs与PAT/bar蛋白通过戊二醛偶联，并用于玻碳工作电极修饰。在分析中，PAT/bar蛋白与固定的抗体发生免疫反应，在传感器表面形成一层免疫复合物，从而抑制了电极表面与ECL活性物质之间的电子转移，导致ECL信号降低。在优化条件下，PAT/bar蛋白在0.10-10ngmL-1范围内与ECL信号强度呈良好的线性关系，检测限为0.050ngmL-1，与已报道的PAT/bar蛋白分析方法相比，该方法显著提高了分析灵敏度。用转基因油菜RF3作为实验材料评价该传感器的适用性，其检测限达0.020%，显示出与PCR方法可比拟的灵敏度。凭借高灵敏ECL检测技术和新型CNPs材料的应用，本文开发的免标记ECL免疫传感器显著提高了外源蛋白分析灵敏度，为转基因成分分析提供了一个有前景的通用型分析平台。
(2)便携式电化学免疫传感器用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT定量分析迄今为止转基因高灵敏POCT定量分析技术的开发尚未报道。本研究采用微型化丝网印刷碳电极(SPCE)作为检测电极，与开发的手持式电化学分析仪集成，基于纳米信号放大探针研发便携式电化学免疫传感器系统，用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT分析。本研究中，通过简单方法将转基因靶标单抗和辣根过氧化物酶(HRP)同时修饰在AuNPs表面制备双标记AuNPs，作为信号放大探针。相比于使用传统的HRP标记抗体作为信号探针，该纳米探针的使用可以显著提高分析灵敏度达62.5倍。在优化条件下，本文构建的便携式免疫传感器可以在0.10-10ngmL-1范围内实现对于CP4-EPSPS蛋白的定量分析，检测限低至0.050ngmL-1，全程分析时间在65min内。该方法用于转基因作物检测并用商业化ELISA试剂盒进行验证，结果显示两者分析结果的相关系数为0.9909。因此，本文提出的便携式电化学免疫传感器系统为外源蛋白高灵敏POCT定量分析提供了可靠的平台。
(3)高灵敏免疫传感平台用于外源蛋白Cry1Ab一步式定量分析。
基于上述高灵敏双标记AuNPs信号探针，结合标记有捕获抗体的免疫磁珠进一步开发了高灵敏免疫传感平台，用于外源蛋白Cry1Ab比色法和化学发光法检测。基于免疫磁珠的分离富集作用，该免疫传感平台利用比色法检测时可以在1.5h内实现Cry1Ab一步式定量分析，线性范围为1.0-40ngmL-1，检测限为0.50ngmL-1。与使用商业化HRP偶联抗体作为信号探针方法相比，该方法的灵敏度提高了15.3倍。同时，高灵敏化学发光法成功应用于该免疫传感平台构建。在0.10-20ngmL-1的线性范围内，可以实现对Cry1Ab最低检出浓度为0.050ngmL-1的定量分析。本文建立的方法已应用于转基因作物检测，与商业化ELISA试剂盒相比，两者分析结果的相关系数为0.9906，显示出良好的一致性。与ELISA相比，该免疫传感平台显著简化了操作步骤，缩短了分析时间，拓展ELISA在POCT分析中的应用。
免疫传感器容易实现微型化和集成化，为外源蛋白现场定量分析提供了一个可行的技术方案。本文基于纳米材料作为固相载体和信号探针载体开发免疫传感新方法以提高外源蛋白分析灵敏度，实现简单、快速、POCT定量分析。研究内容分为三个部分，具体如下：
(1)高灵敏免标记电致化学发光免疫传感器用于转基因作物中外源蛋白PAT/bar定量分析
本文利用打印机碳粉通过简易方法合成新型碳球纳米粒子(CNPs)，基于该纳米材料作为抗体载体和高效电极材料首次构建了免标记电致化学发光(ECL)免疫传感器，用于转基因油菜中外源蛋白PAT/bar高灵敏分析。在本研究中，将CNPs与PAT/bar蛋白通过戊二醛偶联，并用于玻碳工作电极修饰。在分析中，PAT/bar蛋白与固定的抗体发生免疫反应，在传感器表面形成一层免疫复合物，从而抑制了电极表面与ECL活性物质之间的电子转移，导致ECL信号降低。在优化条件下，PAT/bar蛋白在0.10-10ngmL-1范围内与ECL信号强度呈良好的线性关系，检测限为0.050ngmL-1，与已报道的PAT/bar蛋白分析方法相比，该方法显著提高了分析灵敏度。用转基因油菜RF3作为实验材料评价该传感器的适用性，其检测限达0.020%，显示出与PCR方法可比拟的灵敏度。凭借高灵敏ECL检测技术和新型CNPs材料的应用，本文开发的免标记ECL免疫传感器显著提高了外源蛋白分析灵敏度，为转基因成分分析提供了一个有前景的通用型分析平台。
(2)便携式电化学免疫传感器用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT定量分析迄今为止转基因高灵敏POCT定量分析技术的开发尚未报道。本研究采用微型化丝网印刷碳电极(SPCE)作为检测电极，与开发的手持式电化学分析仪集成，基于纳米信号放大探针研发便携式电化学免疫传感器系统，用于外源蛋白CP4-EPSPS高灵敏POCT分析。本研究中，通过简单方法将转基因靶标单抗和辣根过氧化物酶(HRP)同时修饰在AuNPs表面制备双标记AuNPs，作为信号放大探针。相比于使用传统的HRP标记抗体作为信号探针，该纳米探针的使用可以显著提高分析灵敏度达62.5倍。在优化条件下，本文构建的便携式免疫传感器可以在0.10-10ngmL-1范围内实现对于CP4-EPSPS蛋白的定量分析，检测限低至0.050ngmL-1，全程分析时间在65min内。该方法用于转基因作物检测并用商业化ELISA试剂盒进行验证，结果显示两者分析结果的相关系数为0.9909。因此，本文提出的便携式电化学免疫传感器系统为外源蛋白高灵敏POCT定量分析提供了可靠的平台。
(3)高灵敏免疫传感平台用于外源蛋白Cry1Ab一步式定量分析。
基于上述高灵敏双标记AuNPs信号探针，结合标记有捕获抗体的免疫磁珠进一步开发了高灵敏免疫传感平台，用于外源蛋白Cry1Ab比色法和化学发光法检测。基于免疫磁珠的分离富集作用，该免疫传感平台利用比色法检测时可以在1.5h内实现Cry1Ab一步式定量分析，线性范围为1.0-40ngmL-1，检测限为0.50ngmL-1。与使用商业化HRP偶联抗体作为信号探针方法相比，该方法的灵敏度提高了15.3倍。同时，高灵敏化学发光法成功应用于该免疫传感平台构建。在0.10-20ngmL-1的线性范围内，可以实现对Cry1Ab最低检出浓度为0.050ngmL-1的定量分析。本文建立的方法已应用于转基因作物检测，与商业化ELISA试剂盒相比，两者分析结果的相关系数为0.9906，显示出良好的一致性。与ELISA相比，该免疫传感平台显著简化了操作步骤，缩短了分析时间，拓展ELISA在POCT分析中的应用。