背景与目的:肺癌在全球范围和我国均居恶性肿瘤死因首位,可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两大类,其中非小细胞肺癌约占80％以上。据估计,在2000年我国居民肺癌死亡率为19.44/10万,男性为27.16/10万,女性为11.31/10万；在2005我国新发肺癌患者53.64万,死亡47.58万人,男女肺癌发病率分别约为47.6/10万和20.3/10万,男女肺癌死亡率分别为41.1/10万和17.6/10万,均较2000年的死亡率显著上升。约有80％的肺癌患者在诊断时已属晚期,失去治愈的机会,接受化疗后的中位生存期仅为8-10个月,1年生存率约40％。目前肺癌的临床治疗尽管有手术、化疗、放疗等多学科的综合治疗,但总体疗效不佳,5年生存率在我国约为10％。　　 临床上同一分期、同一病理类型、采用同一治疗方案的恶性肿瘤患者,其疗效及预后却常常明显不同。越来越多的研究显示疗效、预后及实际转移情况的差异可归因于个体的分子生物学改变的差异。当今肺癌临床诊治过程中,需要从分子水平寻找相关标志物,建立系统有效的疗效判别、预后预测、分子分期诊断(临床分期基础上的预后亚型细分)等检测体系,真正实现根据个体功能基因组学改变而制定肺癌的个体化治疗方案。　　 分子靶向治疗(targeted therapy)能够在特定患者靶向人群获得显著疗效,也突出了肺癌的分子分型的重要性。如(1)对于EGFR敏感突变的特定人群,EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼和厄洛替尼能明显延长晚期NSCLC患者的无复发生存期。(2)对于ALK融合基因型的患者使用ALK激酶抑制剂(ALK-TKI)能够明显获益。(3)KRAS突变型肺癌的预后和疗效不佳,对多种TKI表现耐药,KRAS靶向治疗策略尚在研究中。基于肺癌发生发展的驱动分子变异(driver mutation)的治疗能够明显获益,然而单一的靶向治疗终究会出现耐药,针对耐药机制和克服耐药的药物正在研发中。随着研究的深入,需要对肺癌进行进一步分子分型,最终获得全面的肺癌分子突变目录(mutation catalog),针对各个分子亚型分而治之。　　 尽管目前KRAS、EGFR、ALK等分子变异在临床已被用于靶向治疗的疗效预测标志物,针对特定患者人群使用靶向治疗能够获得明显疗效,然而对于这几个主要分子未发生变异的患者亚群,该如何进一步提高疗效呢?目前的标准治疗方案是采用铂类化疗为基础的双药化疗,然而其化疗有效率只有约30％。如何提高其疗效是亟需研究的内容。　　 “逃逸死亡”(resisting cell death)是肿瘤细胞的恶性特征之一。肿瘤在发生和演进过程中,凋亡相关信号分子的表达改变贯穿始终。凋亡信号通路总体上可分为凋亡信号的调节分子(regulator)和效应分子(effector)两部分。凋亡的过程基本分为活化过程(activation)或执行过程(execution)。如何活化肿瘤组织中的凋亡促进分子诱导凋亡(如促进Caspase3的剪切活化)是抗肿瘤治疗中的重要课题。　　 本研究拟分析比较EGFR突变型、KRAS突变型、ALK融合突变型、EGFR/KRAS/ALK均为野生型(即EGFRwtKRASwtALKwt,本文称为“EGFR/KRAS/ALK三阴性”或“三阴性”,以下同)非小细胞肺癌的分子表达谱及凋亡信号途径相关分子的表达谱差异、采用免疫组化技术检测分析肺癌标本的凋亡分子表达水平与临床因子的关系、体外分析不同基因变异型肺癌细胞中顺铂(Cisplatinum,Cis)联合CASP3活化剂胱冬肽酶原激活物1(procaspase-activating compound1,PAC-1,可促进细胞内CASP3酶原剪切转变成活化形式的C-CASP3)的抗肿瘤效应。通过体外实验探索在EGFR/KRAS/ALK野生型(突变三阴性)肺癌细胞中凋亡效应分子的活化水平及其靶向药物的抗肿瘤作用机制。　　 第一章 EGFRmut、KRASmut、ALKmut、EGFRwtKRASwtALKwt四种基因型非小细胞肺癌的癌与癌旁组织差异表达凋亡相关标记物的筛选　　 方法:　　 通过知情同意收集广东省人民医院2003年至2006年间,接受根治性手术治疗的非小细胞肺癌患者145例。采用QIAamp DNA blood kit抽提DNA,直接测序法检测EGFR和KRAS突变、采用RACE-PCR-测序法进行检测ALK基因融合状态。将肺癌分为EGFmut、KRASmut、ALKmut及EGFRWtKRASwtALKwt四种分子亚型。采用Ambion公司的mirVana miRNA分离试剂盒抽提total RNA,质控合格后进一步采用Affymetrix全基因组表达谱芯片技术检测各类肺癌及其癌旁组织的基因表达谱(gene expression pattern,GEP)。采用GeneSpring(R)分析软件中的各种统计模块整理分析数据,通过比较分析各个分子亚型的肺癌的癌与癌旁组织中的基因表达差异,着重分析凋亡相关通路分子的表达变化。　　 结果:　　 1.在145例非小细胞肺癌样本中,EGFR突变型有49(33.6％,其中1例同时伴有KRAS突变)例,ALK融合型为12(8.2％)例,KRAS突变型肺癌10(6.8％)例,EGFRwtKRASwtALKwt三阴性肺癌75例,占51.3％。其中EGFR突变与腺癌组织学显著相关(P<0.001)。ALK变异12例中,9例为腺癌,1例为大细胞癌(P=0.093)。KRAS突变10例中,9例为腺癌,1例为大细胞癌(P=0.093)。EGFR、KRAS、ALK三个基因的突变是互相排斥的(仅有一例癌组织ALK融合与EGFR突变共存。EGFR vs KRAS,P=0.016；EGFR vs ALK,P=0.060；ALKvsKRAS,P=1.000)。　　 2.通过RNA质控(RIN>6.0)筛选后,分析了上述肺癌中120例癌组织和53例癌旁组织的全基因组表达谱。在EGFRwtKRASwtALKwt三阴性肺癌中有69例癌组织和36例癌旁组织对比分析；在EGFRmut型肺癌中有32例癌组织和10例癌旁组织对比分析；在KRASmut型肺癌中有9例癌组织和3例癌旁组织对比分析；在ALKmut型肺癌中有10例癌组织和4例癌旁组织对比分析。　　 3.选择FDR(False Discovery Rate)P值设为0.0001时,发现在EGFR突变型肺癌中:差异基因231个。其中2倍变化以上的有216个,上调基因94个,下调基因122个。(注:此处的差异基因是指芯片中的探针集(Probe set),以下芯片数据描述同此)。在KRAS突变型肺癌中:差异基因20个,其中2倍变化以上有20个,上调基因4个,下调基因16个。在ALK融合型肺癌中:差异基因3个,其中2倍变化以上的有2个,均为上调。在EGFRwtKRASwtALKwt肺癌中,FDR设为0.0001的差异基因有7912个。在此基础上筛选2倍差异以上的的基因有5331个,其中2236个在癌组织表达上调,3095个下调。在这四类肺癌中,只有在EGFRwtKRASwtALKwt肺癌中CASP3和PARP1具有显著意义的表达升高。　　 4.将KEGG数据库的凋亡分子列表清单导入数据库,再通过Genespring软件的组件统计模块分析发现,在选择FDR P值为0.01时发现各个基因型的肺癌癌与癌旁组织(有配对组织)的基因表达谱结果为:在EGFR突变型肺癌中:差异基因17个。其中2倍变化以上的有10个,上调的有4个,下调的有6个。在KRAS突变型肺癌中:差异基因2个,其中2倍变化以上有2个,上调的有1个,下调的有1个。在ALK融合型肺癌中:差异基因1个,其中2倍变化以上的有1个,为上调表达。在EGFRwtKRASwtALKwt肺癌中:差异基因74个,其中2倍变化以上的有28个,上调的有12个,下调的有16个。同样发现只有在EGFRwtKRASwtALKwt肺癌中CASP3和PARP1具有显著意义的表达升高。　　 5.在EGFRwtKRASwtALKwt肺癌中,可见CAPN1、IRAK1、BIRC5、FADD、CASP3、PARP1、TRAF2、TNFRSF11A、CYCS、PIK3R2、TNFRSF11A等基因均为显著性上调2倍以上。而IL1R1、PRKAR2B、CSF2RB、TNFRSF10C、TNF、CHP、PIK3R1、IRAK3、TNFRSF10D、PIK3R5、CFLAR、AKT3等基因明显下调2倍以上。　　 结论:　　 在EGFRmut、KRASmut、ALKmut、EGFRwtKRASwtALKwt各分子亚型的肺癌中,从全基因组表达谱或凋亡信号通路表达谱的芯片数据分析均可见凋亡信号分子的表达异常。并发现在EGFRwtKRASwtALKwt野生型肺癌中特异性地出现CASP3、PARP1在癌组织中的表达显著升高,提示可能作为潜在的干预分子靶点。CASP3、PAPR1在EGFR突变型、KRAS突变型、ALK融合型肺癌癌组织与癌旁组织比较中未发现显著性差异的改变。　　 第二章基于组织芯片的免疫组化技术检测凋亡分子的蛋白表达水平　　 方法:收集广东省肺癌研究所2000年1月～2006年6月非小细胞肺癌切除组织石蜡标本144例。应用Beecher Instruments公司的组织芯片制备仪制备组织芯片。组织芯片中包括26例癌组织和癌旁组织的配对石蜡标本。癌旁组织标本取自离肿瘤组织边缘5-7cm处的肺组织。采用免疫组织化学方法检测分析CASP3、CASP8、CASP9、PARP1、Cleaved CASP3(剪切后活化形式的CASP3,C-CASP3)、CleavedPARP1(胱冬肽酶剪切PARP1形成89Kd的大片段,即C-PARP1)、XIAP、BCL2等八个分子的蛋白表达水平。　　 每个肿瘤样本分别根据染色强度(阴性=0、弱阳性=1、中等阳性=2、强阳性=3)和染色范围(0％=0、1-10％=1、11-50％=2、51-80％=3、81—100％=4)评分。然后将这两项得分相乘,得到一个IHC积分,范围由0分至12分。将IHC积分≥6的认为是该蛋白分子高表达,低于6分的计为该蛋白分子低表达。　　 结果:　　 1.配对的癌与癌旁组织中凋亡相关分子的表达水平分析　　 在可分析的25例配对的癌与癌旁组织比较分析发现,CASP3、C-CASP3、PARP1、CASP9、BCL2、XIAP等分子在癌组织均有显著性差异的升高表达(P<0.01)。C-PARP1、CASP8在癌与癌旁两组间未见显著差异(P>0.05)。　　 2.非配对的癌(n=139)与癌旁组织(n=25)中凋亡相关分子表达水平　　 非参数秩和检验结果提示CASP3、C-CASP3、PARP1、CASP9、BCL2、XIAP两组间比较发现在癌组织均有显著性差异的升高表达(P<0.01)。C-PARP1在癌与癌旁两组间未见显著差异(P>0.05)、CASP8分子在癌组织表达显著性低于在癌旁组织的表达(P<0.05)。　　 3.EGFRwtKRASwtALKwt(突变三阴性)肺癌组织凋亡相关分子表达水平分析　　 在EGFRwtKRASwtALKwt(突变三阴性)肺癌中,非参数秩和检验结果提示CASP3、C-CASP3、PARP1、CASP9、BCL2、XIAP两组间比较发现在癌组织均有显著性差异的升高表达(P<0.01)。C-PARP1在癌(n=51)与癌旁(n=12)两组间未见显著差异(P>0.05)、CASP8分子在癌组织表达显著性低于在癌旁组织中的表达(P<0.05)。　　 进一步分析凋亡分子在突变三阴性(TriNeg)与非三阴性(non-TriNeg)的癌组织表达水平发现,CASP3和BCL2在三阴性肺癌组织中表达显著性高于非三阴性癌组织(P<0.05),CASP8分子在三阴性癌组织表达显著性低于非三阴性癌组织(P<0.05),其它分子表达水平在此两组间未见统计学差异(P>0.05)。　　 4.凋亡分子表达与临床病理、生存因素之间的关系　　 C-CASP3、CASP8在非鳞癌中表达高于鳞癌(P<0.05),BCL2、PARP1等在鳞癌表达高于非鳞癌(P<0.05)。PARP1也与男性、吸烟等因素相关(P<0.05)。　　 在三阴性肺癌中,CASP3的表达水平与OS之间存在负相关趋势,即CASP3低表达者与高表达者比较具有较长生存的趋势(P=0.165)；PARP1的表达水平与OS之间存在正相关趋势,即PARP1高表达者与低表达者比较具有较长生存的趋势(P=0.198)；C-PARP1的高表达与低表达组间生存未见统计学差异(P=0.617)。　　 在非三阴性肺癌中,CASP3的表达水平与OS之间存在正相关趋势,即CASP3高表达者与低表达者比较具有较长生存的趋势(P=0.196)；PARP1的表达水平与OS之间存在负相关趋势,即PARP1低表达者与高表达者比较具有较长生存的趋势(P=0.198)；C-PARP1的高表达与低表达组间总生存可见统计学差异(P<0.001),C-PARP1高表达者生存预后相对较差。　　 Kaplan-Meir生存曲线分析和多变量Cox回归模型分析发现除了疾病分期或组织学类型与NSCLC的总生存(overall survival,OS)有关联,可见C-PARP1分子高表达与肺癌患者的较短的中位总生存期关联,初步提示C-PARP1可能是肺癌的独立的不良预后因子。　　 结论:　　 蛋白表达水平证实在配对或非配对的癌与癌旁组织比较中,CASP3、PARP1、CARP9、XIAP、BCL2等凋亡调节或效应分子均在癌组织有统计学意义的表达升高。CASP3和PAPR1在EGFRwtKRASwtALKwt(突变三阴性)肺癌组织中较癌旁组织有显著差异的表达升高,且CASP3和BCL2在突变三阴性肺癌较非三阴性肺癌组织的表达也有显著升高。提示CASP3在三阴性肺癌中是特异的分子标志物,可能被作为抗肿瘤靶点。CASP3、CASP8在非鳞癌中表达高于鳞癌,BCL2、PARP1等在鳞癌表达高于非鳞癌。PARP1也与男性、吸烟等因素相关。提示PARP1可能是吸烟者肺癌、鳞癌等亚群患者治疗的重要靶点之一。　　 Kaplan-Meir生存曲线分析和多变量Cox回归模型分析发现提示C-PARP1表达水平可能是OS的独立预后因子。　　 第三章顺铂联合PAC-1在不同遗传变异背景的肺癌细胞系中的抗肿瘤效应方法:　　 选择H1299(EGFRwtKRASwtALKwt)、A549(KRASmut)、PC9(EGFRmut)、H1650(EGFRmut)、H1975(EGFRmut)等不同遗传变异背景的细胞系作为实验模型,采用抗增殖MTT(噻唑蓝)显色实验分析顺铂、PAC-1(Caspase3活化剂即胱冬肽酶原激活物1,procaspase-activating compound1)单药或联合用药对肿瘤细胞的杀伤效应及协同效应。采用Western Blot方法检测CASP3、CASP9、C-CASP3、PARP1、C-PARP1、XIAP及BCL2的表达变化(ACTB为内参照)。流式细胞术检测了各个实验组的细胞周期变化。采用免疫细胞荧光技术检测PAC-1处理前后细胞中的CASP3、C-CASP3的蛋白水平变化。　　 结果　　 1.MTT实验结果　　 单药顺铂对H1299、A549、PC9、H1650、H1975在一定剂量条件下均有抗增殖效应,IC50值为1.9～11.2μmol/L。PAC-1对各株细胞在一定剂量条件下也具有抗增殖效应,IC50值为7.4～14.8μmol/L。当将两药联合使用时,只在H1299细胞中发现同时联合或Cis→PAC-1序贯用药具有协同杀伤作用。在其它4株细胞中未发现协同作用,多表现为拮抗作用(联合指数CI值>1.1)。　　 2.流式细胞术检测药物干预的细胞周期结果:　　 结果显示在所有5株不同遗传变异背景的细胞中,PAC-1会阻滞细胞于G1期,而Cis会促进细胞阻滞于G2期。在三阴性(EGFRwtKRASwtALKwt)H1299细胞中Cis→PAC-1序贯联用具有最强的促凋亡作用。　　 3.Western Blot结果:　　 结果显示在H1299细胞中PAC-1单药、顺铂联合或序贯PAC-1均能够明显促进CASP3剪切向活化形式的C-CASP3转变(即CASP3→C-CASP3转变),使得C-CASP3的水平升高。而在PC9和H1975细胞中,PAC—1具有较弱的诱导CASP3酶原活化成C-CASP3的作用。在H1299细胞中的基线C-PARP1水平较低,而在PC9、H1975细胞中基线C-PARP1相对较高。PAC-1在H1299和PC9细胞中具有一定的抑制基线或顺铂诱导的PAPR1→C-PARP1的转变。但C-PARP1的具体生物学功能需进一步研究。　　 4.免疫细胞化学结果:进一步采用免疫细胞化学染色观察了在各种细胞株中PAC-1促进CASP3酶原向活化形式的C-CASP3转变(即CASP3→C-CASP3转变)的情况。结果发现PAC-1在EGFRwtKRASwtALKwt(三阴性,即EGFR、KRAS、ALK均为野生型)的H1299细胞中促进CASP3酶原向活化形式的C-CASP3转变过程的能力最明显,提示PAC-1在H1299细胞中可发挥明显的促凋亡作用。而在A549、H1650、H1975、PC9等细胞中PAC-1均促进CASP3酶原向C—CASP3转变的效应很弱或不明显。　　 结论:初步细胞实验结果显示在EGFR/KRAS/ALK野生型的H1299细胞株中,Cis联合PAC-1用药具有更好的协同杀伤作用。而在EGFR突变的PC9、H1650、H1975和KRAS突变的A549中,PAC-1联合顺铂在细胞生长抑制方面表现为相互拮抗作用。PAC-1在EGFR/KRAS/ALK野生型的H1299细胞株中能够明显促进CASP3酶原的功能活化。PAC-1可能在野生型细胞中特异性地通过诱导CASP3活化成C-CASP3发挥促凋亡作用而协同铂类抗肿瘤细胞增殖。