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目的:1.探讨广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性。2.揭示rNTP促进T7 DNA复制的现象及机制。方法:1.广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性稳态动力学方法获得gp90 exo-或Dpo4在dG,rG,or 8-oxoG三个模板的对侧催化单个dNTP或者单个rNTP插入的kcat和Km参数,采用三种错配的dNTP和四种rNTP的错配率来阐述广义错配率。2.rNTP促进T7 DNA复制及其机制的探讨2.1 A家族DNA聚合酶在恒定dNTPs浓度,逐渐增加rNTPs的浓度条件下进行全长延伸反应。2.2证实rNTP促进T7 DNA复制现象的存在:采用有外切活性的Pol T7代替Pol T7-、变化酶浓度、变化Mg2+浓度和采用其他随机的DNA序列。2.3采用RNase H1和RNase H2酶切延伸产物确定新合成的双链DNA中核苷酸的种类。2.4电泳迁移实验检测在dNTPs和（或）rNTPs存在时Pol T7-与DNA形成复合物的情况。2.5表面等离子共振实验体分析在d NTPs和（或）rNTPs存在时Pol T7-与DNA的亲和力。结果:1.广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性对绝大部分DNA聚合酶来说,三种错配的dNTP掺入导致的狭义错配率小于三种错配的dNTP联合四种rNTP的错误掺入导致的广义错配率,广义错配率更能反应DNA聚合酶的保真性。2.rNTP促进T7 DNA复制2.1在dNTPs和rNTPs存在的条件下,Pol T7-和KF exo-催化的引物延伸分别在20:1和5:1比例时表现出最大的促进效应,gp90 exo-催化的延伸反应随着rNTP/dNTP比例增加逐渐受到抑制。说明额外存在的适当浓度的rNTPs可以促进T7 DNA复制。2.2变化引物延伸的条件,在额外的适当浓度rNTPs存在时促进现象重现,并在rNTP/dNTP为20:1时最明显。2.3在额外的适当浓度rNTPs条件下,Pol T7-催化的的全长延伸产物用RNase H1和RNase H2酶切,结果表明几乎无rNTP的插入,排除由于rNTP直接插入促进DNA复制的可能性。2.4电泳迁移实验表明,促进现象是由于Pol T7-与DNA形成了更多且更稳定的复合物。2.5表面等离子共振实验发现rNTP/dNTP为20:1条件下Pol T7-与DNA的亲和力更大。结论:1.相比于传统的狭义错配率,广义错配率能更加精准描述DNA聚合酶的保真性。2.额外存在的适当浓度的rNTPs促进T7 DNA的复制,最大促进效应在rNTP/dNTP为20:1时。促进现象是由于形成的复合物更多且更稳定,同时DNA聚合酶与DNA的亲和力增加,并不是由于rNTP的直接插入所致。