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白血病的发生和发展是一种多基因参与,多因素影响的多步骤复杂过程。主要表现为白血病细胞增殖失控,分化障碍及其凋亡受阻。生理情况下,细胞的增殖、分化、成熟及凋亡受到多种正负调控因子的严格的调控,正、负调节信号处于动态平衡中,维持着造血的稳定。负调控因子作用的减弱可能导致白血病的发生。TGF-β1是最主要的负调控因子之一,TGF-β信号转导通路在调节造血细胞的增殖,诱导细胞分化、凋亡等方面具有重要的作用。TGF-β受体有3种亚型即TGF-βRI、TGF-βRII和TGF-βRⅢ,其中TGF-βRII和TGF-β具有较高的亲和力,在TGF-β介导的信号转导中起着重要的作用。研究表明一些肿瘤中发现有TGF-βRⅡ表达异常,如在胰腺癌、胆囊癌中存在TGF-βRⅡ水平下调,在结肠癌中TGF-βRⅡ发生突变,导致功能失活,肿瘤细胞因此失去对TGF-β的敏感性。为了解急慢性白血病患者TGF-βRⅡ基因是否存在异常,本课题组前期通过PCR方法扩增急性白血病原代细胞TGF-βRⅡ的编码区序列,并将TGF-βRⅡ的编码区序列连接到T载体上,再将其转化感受态细菌,PCR鉴定阳性菌落,挑取单个菌落,送公司测序,在国际上首次发现白血病病人存在两种TGF-βRⅡ的异构体,即TGF-βRIIA和TGF-βRIIB(2号外显子75bp缺失)。由于前期研究仅挑取单个菌落测序,具有一定的局限性,并不能反映这两种异构体在白血病细胞的表达量的差别。TGF-βRIIA和TGF-βRIIB这两种异构体差别在2号外显子的缺失,因此本研究在1号外显子和3号外显子设计了上下游引物,通过RT-PCR的方法,检测这两种异构体在白血病细胞的表达情况。避免了前期研究的局限性及测序的繁琐性。同时也对这两种异构体的功能进行了研究。本研究内容包括以下3个方面:1.RT-PCR方法检测TGF-βRⅡ两种异构体在正常人外周血或骨髓单个核细胞细胞、急慢性白血病初治患者骨髓单个核细胞及不同的白血病细胞系中的表达情况。2.构建含人TGF-βRⅡ两种异构体基因的真核表达载体,用脂质体分别转染TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB均低表达的K562细胞,筛选出稳定表达TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562细胞。3.研究TGF-β1对稳定表达TGF-βRⅡA或TGF-βRⅡB基因的K562细胞增殖、分化、凋亡的影响,以及对TGF-β信号通路下游基因与蛋白表达的影响。取得了以下主要结果:1.在正常人外周血或骨髓单个核细胞中以TGF-βRⅡA表达为主。在急慢性白血病细胞中以TGF-βRⅡB表达为主,在白血病细胞系中,K562细胞株、KAR细胞株TGF-βRⅡA及TGF-βRⅡB基因均低表达。U266、U937、Raji、HL-60、Jurkat、CEM、NB4、CA46等细胞株均有表达TGF-βRⅡA及TGF-βRⅡB基因。2.成功地构建含人TGF-βRⅡ两种异构体基因的真核表达载体,经测序确认,命名为pEFIRES-N- TGF-βRⅡA和pEFIRES-P - TGF-βRⅡB ,分别转染TGF-βRⅡA和TGF-βRⅡB均低表达的K562细胞,经抗性筛选,得到稳定表达细胞株,分别命名为TGF-βRⅡA-K562细胞及TGF-βRⅡB-K562细胞3.通过不同剂量TGF-β1作用下,证实了低剂量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡA-K562细胞增殖,并诱导细胞分化、凋亡。但此剂量TGFβ1不能抑制TGF-βRⅡB -K562细胞增殖,也不能诱导细胞分化、凋亡。随着TGFβ1剂量的增加,TGF-βRⅡB -K562细胞增殖也能受到抑制,并呈量效关系,但抑制率不如TGF-βRⅡA-K562细胞。4. RT-PCR,Western-Blot检测发现,低剂量TGFβ1(1ng/ml)能上调TGF-βRⅡA -K562细胞Smad2/3基因表达,下调TGF-βRⅡA -K562细胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表达,这可能是诱导细胞凋亡的作用机制。此剂量的TGFβ1不影响TGF-βRⅡ-B细胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表达。结论:1.在正常人外周血或骨髓单个核细胞中以TGF-βRⅡA表达为主。在急慢性白血病细胞中以TGF-βRⅡB表达为主,在白血病细胞系中,K562细胞株、KAR细胞株TGF-βRⅡA及TGF-βRⅡB基因均低表达。2.低剂量TGFβ1(1ng/ml)即能抑制TGF-βRⅡA-K562细胞增殖,并诱导细胞分化、凋亡。但此剂量TGFβ1不能抑制TGF-βRⅡB -K562细胞增殖,也不能诱导细胞分化、凋亡。随着TGFβ1剂量的增加,TGF-βRⅡB -K562细胞增殖也能受到抑制,并呈量效关系,但抑制率不如TGF-βRⅡA-K562细胞。3.低剂量TGFβ1(1ng/ml)能上调TGF-βRⅡA -K562细胞Smad2/3基因表达,下调TGF-βRⅡA -K562细胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表达,这可能是诱导细胞凋亡的作用机制。此剂量的TGFβ1不影响TGF-βRⅡ-B细胞bcl-2、c-myc基因及蛋白表达。