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环盒子1(Ring-box l,RBX1)是SCF-E3泛素-蛋白连接酶复合体中的指环亚基,通过靶向降解不同的底物蛋白而发挥调节多种细胞生物学过程的作用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是有机体细胞内选择性靶向降解蛋白质的重要途径,对机体面临环境应激时维持稳态具有相当重要的意义。当UPS对靶蛋白的降解功能发生异常时,可能会引起抑癌蛋白异常降解、癌蛋白聚集、增殖加速、突变细胞的凋亡受阻等,从而诱导肿瘤的发生发展。RBX1是SCF泛素-蛋白连接酶E3的重要组成部分,逐渐受到研究肿瘤学者的重视。RBX1存在于动植物的细胞质和细胞核中,进化上比较保守。不同物种中RBX1家族的蛋白质含有108~121个氨基酸,分子量约为12~16 k Da。人RBX1包含一个环指-H2结构域,对锌离子结合和泛素连接是必需的。作为泛素连接酶E3的重要组成部分,RBX1在肿瘤发生时表达异常而无法起到调节作用,不能诱导肿瘤细胞的凋亡和衰老,在肿瘤发生发展过程中至关重要,但具体分子机制尚不是很明确。鞭毛(flagellum)/纤毛(cilium)在进化上异常保守,不仅可以作为运动推动器,还可以接收其他细胞以及外界环境的物理和化学信号,并传递到细胞内从而引起细胞反应。鞭毛/纤毛功能和结构上的异常能够导致一系列鞭毛/纤毛相关疾病的发生。目前关于鞭毛/纤毛组装与解聚及“鞭毛/纤毛相关疾病”发生机理的认识,大多是通过对模式生物的遗传学研究获得的,这是由于直接以人类细胞作为研究对象进行鞭毛/纤毛相关研究相当困难。杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种极度耐盐的真核单细胞藻类,无细胞壁,生长周期短,易培养,具有等长的一对双鞭毛,非常适合作为研究鞭毛结构组装的模式生物。本实验室前期转录组测序结果表明,RBX1的转录片段在鞭毛再生过程中,表达量明显下调,但具体分子机制还需进一步研究。为初步探究杜氏盐藻RBX1在鞭毛再生过程中的分子调控机制,本实验拟构建RBX1的酵母诱饵表达载体p GBKT7-rbx1,利用酵母双杂交技术,从本课题组构建的杜氏盐藻鞭毛再生c DNA酵母文库中筛选能够与盐藻RBX1相互作用的蛋白并验证其相互作用,初步研究互作蛋白在杜氏盐藻鞭毛调控中的作用。为深入研究RBX1在鞭毛调控中的生物学功能奠定基础。方法1、酵母双杂交筛选杜氏盐藻RBX1的互作蛋白及相互作用验证PCR扩增杜氏盐藻rbx1的开放阅读框,测序验证后插入酵母表达质粒构建诱饵载体p GBKT7-rbx1。将酶切鉴定正确的诱饵载体,用PEG/Li Ac法分别转化到酵母菌株Y187和AH109中,通过表型筛选检测RBX1对酵母菌株有无自激活和毒性作用,鉴定诱饵质粒p GBKT7,p GBKT7-rbx1是否适用于酵母双杂交方法。随后,将转化诱饵质粒p GBKT7-rbx1的Y187菌株与文库菌AH109杂交,待三叶草形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选杜氏盐藻RBX1的互作蛋白,获得阳性克隆。并将提取的酵母质粒和诱饵质粒共转化酵母细胞AH109中进行回交实验验证互作蛋白的相互作用。2、互作蛋白在杜氏盐藻鞭毛再生调控过程中的表达变化运用机械法脱去对数生长期杜氏盐藻的双鞭毛,然后在鞭毛再生过程中不同时间点收集藻细胞,以未脱鞭毛的藻细胞为对照,以盐藻GAPDH作为内参,用实时荧光定量PCR的方法检测互作蛋白在鞭毛再生过程中的相对表达量。结果酵母双杂交筛选RBX1的互作蛋白扩增得到杜氏盐藻rbx1的开放阅读框,测序验证后连入p GBKT7,成功构建酵母双杂交诱饵表达载体p GBKT7-rbx1。随后转入酵母菌株AH109和Y187中,经过毒性实验和自激活作用的验证,诱饵表达载体p GBKT7-rbx1对宿主酵母细胞即没有毒性,也没有自激活作用,证明适用于酵母双杂交实验。以p GBKT7-rbx1为酵母双杂交诱饵表达载体从杜氏盐藻鞭毛再生c DNA酵母文库中共筛选得到298个阳性单克隆,最后筛选得到的是603 bp的基因片段。经测序鉴定和同源性比对分析,该基因与莱茵衣藻和拟南芥中氧化还原酶铁硫蛋白亚基同源性分别为38%和39%,故称之为类氧化还原酶铁硫蛋白亚基(Ds ferredoxin thioredoxin reductase subunit,Ds FTR subunit)。用实时荧光定量PCR的方法检测该亚基在杜氏盐藻鞭毛再生过程中m RNA相对表达量的变化(P﹤0.001),结果表明在鞭毛再生1~3 h内表达量呈上升趋势,3 h时达到最大值,随后表达量下降。将酵母双杂交猎物质粒p GADT7-Ds FTR与已构建的酵母双杂交诱饵表达载体p GBKT7-rbx1共转化酵母细胞AH109中,观察发现其在酵母固体营养缺陷型培养基上状态良好,并用X-α-gal进行蓝白斑筛选,结果呈蓝色,此回交实验证实杜氏盐藻RBX1与氧化还原酶铁硫蛋白亚基在酵母细胞中存在相互作用。结论利用酵母双杂交技术,在杜氏盐藻中成功筛选得到RBX1互作蛋白类氧化还原酶铁硫蛋白亚基,并通过回交实验进行了进一步的验证。在杜氏盐藻鞭毛再生过程中,类氧化还原酶铁硫蛋白亚基m RNA表达水平呈先升高随后降低的趋势,RBX1可能是通过介导某些蛋白的降解,影响了类氧化还原酶铁硫蛋白亚基的表达。