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第一部分黏蛋白MUC4的表达与胰腺导管腺癌的演进及预后相关目 的研究MUC4基因表达与胰腺癌演进和预后的关系,为胰腺癌的早期诊断和预后判断提供依据。方 法采用实时定量PCR联合显微切割技术,精确提取57例胰腺导管腺癌（PDAC）病例的116个癌前及癌的病灶中的MUC4 mRNA并分析其表达水平,研究MUC4表达在正常胰腺导管（NP）、低级别胰腺上皮内瘤变（PanIN-L）、高级别胰腺上皮内瘤变（PanIN-H）和PDAC的差异,分析MUC4mRNA表达与PDAC病例的临床参数和生存期的相关性,利用Cox比例风险模型进行预后分析。结 果MUC4是一种胰腺癌特异性表达的基因,其显著增加与PDAC的发生和演进相关。MUC4的mRNA表达水平与TNM分期正相关。Cox回归分析表明,TNM分期（P= 0.038）和MUC4的表达（P = 0.008）是预测PDAC患者预后的重要独立危险因素。结 论MUC4是有价值的胰腺癌早期诊断和预后判断的标志物。显微切割技术可精准地对标靶细胞/组织进行定位和筛选,可用来避免所研究组织异质性产生的干扰,联合标准化的定量RT-PCR技术,可实时定量地研究体内病变发生、发展时分子水平的改变。第二部分剪接变体MUC4/Y和NIDO-AMOP-vWD结构域区在胰腺癌细胞中的功能研究目 的研究人黏蛋白4的剪接变体MUC4/Y基因与NIDO-AMOP-vWD区在胰腺癌恶性生物学行为中的作用。方 法1.构建与鉴定MUC4/Y与MUC4/Y-QNAV基因（MUC4/Y基因片段上缺失NIDO-AMOP-vWD,命名为 MUC4/Y-@NIDO-AMOP-vWDΔ,简称 MUC4/Y-QNAV）的慢病毒的表达载体,包装生产携带目的基因的慢病毒颗粒;2.用携带目的基因的慢病毒颗粒感染不表达MUC4的胰腺癌细胞系PANC-1,用嘌呤霉素筛选出过表达目的基因的稳转细胞系,并通过实时定量PCR法、western blot法、免疫荧光法鉴定目的基因在mRNA和蛋白水平的表达与定位,证明成功建立了过表达MUC4/Y与MUC4/Y-QNAV基因的稳转胰腺癌细胞系,命名为 PANC-1-MUC4/Y、PANC-1-MUC4/Y-QNAV;3.以野生型PANC-1、稳转细胞系PANC-1-EV（EmptyVector,空载）分别作为空白和阴性对照组,稳转胰腺癌细胞系PANC-1-MUC4/Y、PANC-1-MUC4/Y-QNAV作为实验组,进行平行的体外功能实验,明确过表达目的基因对胰腺癌细胞的体外恶性生物学行为的影响:CCK8法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术（Annexin-V/7-AAD双染法）检测各组细胞抗凋亡能力;Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力;粘附实验检测各组细胞与基质蛋白的粘附能力;4.用GFP（绿色荧光蛋白）/Luciferase（荧光素酶,Luc）双标签慢病毒再次感染各细胞株,然后通过流式细胞分选仪分选GFP+细胞,最终筛选建立起荧光素酶高表达、目的基因过表达的稳定克隆株,分别命名为PANC-1-EV-Luc、PANC-1-MUC4/Y-Luc 和 PANC-1-MUC4/Y-QNAV-Luc;5.在建立各组细胞的皮下荷瘤裸鼠模型的基础上,监测动物的一般情况,结合活体成像、解剖大体观察和病理,检测和比较各分组肿瘤细胞体内生长能力和自发转移能力,明确MUC4/Y与MUC4/Y-QNAV基因对胰腺癌细胞体内恶性生物学行为的影响。结 果1.过表达目的基因的稳转胰腺癌细胞系的建立与鉴定:实时定量PCR法检测示目的基因MUC4/Y在稳转细胞系PANC-1-MUC4/Y中的表达量显著上调,是空载对照细胞系PANC-1-EV的1262倍;目的基因MUC4/Y-QNAV在稳转细胞系PANC-1-MUC4/Y-QNAV中的表达量显著上调,是空载对照细胞系PANC-1-EV的1472倍。western blot和免疫荧光结果示所筛选建立的稳转胰腺癌细胞系中目的基因编码的蛋白不但表达而且定位在细胞质中和膜上,与野生型MUC4蛋白相同。2.体外功能检测证明:MUC4/Y基因与胰腺癌细胞低营养状态下的增殖能力、抗晚期凋亡能力、侵袭转移能力正相关;3个相邻结构域区缺失,减弱了 MUC4/Y基因的抗晚期凋亡能力、促侵袭转移能力;MUC4/Y基因过表达,使胰腺癌细胞分别与基质蛋白Collage Ⅳ、FN及LN的粘附能力增强;NIDO-AMOP-vWD结构域区可能是MUC4/Y蛋白与基质蛋白Collage IV、FN、LN相互作用的关键位点;3.皮下荷瘤裸鼠模型的体内实验证明:MUC4/Y基因有促进生长和自发转移的作用;3个相邻结构域区缺失,削弱了 MUC4/Y基因的促生长、促成瘤和促转移的能力。结 论1.MUC4/Y基因在胰腺癌恶性生物学行为（增殖、抗凋亡、粘附、体内成瘤、转移）中起重要作用。2.NIDO-AMOP-vWD结构域区是MUC4/Y基因上的重要功能区,与胰腺癌恶性生物学行为密切相关。第三部分过表达MUC4/Y基因的数字基因表达谱分析及MUC4/Y介导的胰腺癌侵袭转移信号通路的预测和验证目 的构建过表达MUC4/Y基因的胰腺癌细胞的转录组文库,通过对文库的生物信息学分析,为胰腺癌的基础及临床研究提供新的线索。方 法1.采用RNA高通量测序测序技术,对胰腺癌细胞系PANC-1-EV和PANC-1-MUC4/Y的转录组文库进行了数字基因表达谱测序（DGE）、组装和生物信息学分析;2.在DGE结果基础上,用定量PCR、Western blot技术和通路阻断实验,预测和验证MUC4/Y上调胰腺癌侵袭转移相关分子MMP-7表达的信号转导通路;3.通过荧光素酶报告基因、干扰与阻断PANC-1-MUC4/Y细胞中Elk1的表达、转录因子结合位点预测和对MMP-7启动子中Elk-1结合位点进行缺失和定点突变分析等多种研究手段,验证MUC4/Y基因依赖转录因子Elk1启动MMP-7基因的转录。结 果1.在成功构建的转录组文库的基础上,共检测到基因22748个,从中筛选出147个差异表达基因,其中上调表达基因为128个,下调的为19个,参与了 111个信号转导通路;2.预测并证实了 MUC4/Y 经 ErbB2-PI3K-AKT-mTOR、ErbB2-FGFR3-Ras-Raf-MEK-MAPK/ERK1/2、ErbB2-Src-FAK-ERK1/2、ErbB2-Src-FAK-JNK的4条通路的部分作用上调MMP-7的表达,介导胰腺癌侵袭转移;3.发现并验证了 MUC4/Y通过上调和激活Elk-1来启动MMP-7的转录,MMP-7启动子序列中-215/-203处为Elk-1功能性结合位点,MMP-7是Elk-1的靶基因。结 论剪接变体MUC4/Y分子通过C端的多个EGF样结构域作用ErbB2,促其启动与活化下游的多条信号转导通路来上调MMP-7的表达,以及通过激活转录因子Elk-1调控MMP-7的转录,可能是其介导胰腺癌侵袭转移的机制之一。信号数字基因表达谱技术能够在整体水平研究某一生物对象在特定生物过程中基因表达差异,可快速高效地筛选、确定肿瘤相关基因,揭示其生物学过程以及疾病发生过程,为研究肿瘤分子发病机理、拓展肿瘤诊断和个体化治疗手段提供了一条新的思路。