实现抗生素替代是动物营养领域的重点研究方向。目前开发的抗生素替代品包括抗菌肽、酶制剂、酸化剂、植物提取物、中草药添加剂、益生菌等,其中溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌具有高效、特异性的抑制作用,表现出良好的替抗潜力。金黄色葡萄球菌是造成仔猪、雏鸡等幼畜腹泻疾病以及奶牛乳房炎的主要病原菌,而溶葡萄球菌酶能够特异性结合并裂解金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸-甘氨酸键,导致金黄色葡萄球菌细胞裂解死亡,因此溶葡萄球菌酶可作为一种新型抗生素替代品,有效预防幼畜腹泻和奶牛乳房炎的发生。目前,生物合成溶葡萄球菌酶是实现其实际应用的有效方式,但其产量较低、纯化工艺较为复杂,导致溶葡萄球菌酶的成本居高不下,很难应用于畜牧生产。为此,本论文以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为表达宿主,实现了溶葡萄球菌酶的异源表达,表达产物抑菌活性突出;进而通过随机突变和定向进化的方法,获得了活性、产量更优良的溶葡萄球菌酶。主要研究进展如下:（1）大肠杆菌与枯草芽孢杆菌表达载体的构建。首先将溶葡萄球菌酶编码基因lss片段与表达载体p ET28a、p GJ103和p HT43通过Gibson Assembly连接,成功构建p ET28a-lss、p GJ103-lss和p HT43-lss。三种溶葡萄球菌酶重组表达质粒,分别在表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）（p ET28a-lss）与枯草芽孢杆菌WB800N（p GJ103-lss、p HT43-lss）中实现了溶葡萄球菌酶的可溶性表达,表达产物对BL21（DE3）和WB800N无明显抑制作用。溶葡萄球菌酶在BL21（DE3）中的表达量比在枯草芽孢杆菌WB800N中高,约为枯草芽孢杆菌表达量的10倍,但从WB800N中的纯化方式更为简单。（2）溶葡萄球菌酶的效价评估。利用BCA法与Western Blot对BL21（DE3）/p ET28a-lss表达体系的溶葡萄球菌酶表达量进行定性定量测定,发现该酶产量为4 mg/m L;接着通过最小抑菌浓度测定、牛津杯抑菌试验、最适温度测定等方法对该酶进行活性测定,结果表明,通过琼脂稀释法与微量肉汤稀释法得到的最小抑菌浓度结果差异较大,琼脂稀释法得到的值约为微量肉汤稀释法的4-16倍;当溶葡萄球菌酶浓度仅为4μg/m L时,即可抑制所有金黄色葡萄球菌的生长,而其对溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的杀灭能力显著低于对金黄色葡萄球菌杀灭能力的16-32倍,二者可能是由于不同菌类细胞壁的结构差异导致。在牛津杯抑菌试验中,浓度为100μg/m L的溶葡萄球菌酶对20株金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小约为2.73 mm,而同等浓度苯唑西林产生的抑菌圈难以辨认。最后,溶葡萄球菌酶的最适温度为40℃。（3）随机突变。通过易错PCR扩增lss片段,将扩增产物与p ET28a通过Gibson Assembly连接,转化入大肠杆菌BL21（DE3）获得溶葡萄球菌酶突变库。通过评价诱导时间与单克隆大小对蛋白表达量的影响,成功优化基于96孔板的溶葡萄球菌酶高通量筛选方法。挑取大小相似的突变单克隆,高通量筛选获得6个表现良好的突变体,分别为Mut-A96、Mut-A77、Mut-A92、Mut-A46、Mut-A95、Mut-A87,其中Mut-A77（H35W、V149A、S189G）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BA01611的杀菌能力比野生型更强。因此,利用定点突变的方式依次构建并表达了3个突变蛋白（Lyso（H35W）、Lyso（V149A）、Lyso（S189G））,最终发现只有3个突变位点同时存在时,才能够提高溶葡萄球菌酶对金葡菌的抑菌能力;同时Mut-A77及其3个点突变蛋白的表达量升高,约为野生型表达量的2-4倍。综上所述,本研究成功实现了溶葡萄球菌酶在大肠杆菌BL21（DE3）与枯草芽孢杆菌WB800N中的异源表达,得到最高表达量为4 mg/m L的溶葡萄球菌酶。抑菌效价测定发现,溶葡萄球菌酶的专一性极强,当其浓度为4μg/m L时,即可抑制所有金黄色葡萄球菌的生长,分别是溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的1/16和1/32。随机突变和定向进化试验得到了一个针对金黄色葡萄球菌抑菌效果更为突出的突变体Mut-A77（H35W、V149A、S189G）,并发现Mut-A77及其3个点突变蛋白的表达量均高于野生型。本试验为溶葡萄球菌酶的高通量筛选建立了技术基础,获得的异源表达溶葡萄球菌酶具有良好的抑菌活性,为应用溶葡萄球菌酶预防幼畜腹泻和奶牛乳房炎的发生提供了新方案。