研究背景椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease, DDD)是指椎间盘组织在多种原因综合作用下发生生物学变性进而引起椎间盘力学特性改变,使邻近的骨关节、韧带发生相应变化,影响脊柱功能甚至压迫脊髓、神经根、椎动脉,已逐渐成为颈肩腰背疼痛的主要病因。它不仅降低了人民的生活质量同时导致大量劳动力、物力和财力的损失。目前的治疗主要包括有保守治疗与手术治疗,但是这些治疗方法都不是针对椎间盘退变的根本原因,不能从根本上治愈椎间盘退变,只能改善椎间盘退变所引起的症状,而且有些手术治疗甚至会引起临近节段的失代偿以及加重腰椎不稳。因此目前国内外许多学者正探索能修复椎间盘功能的生物学治疗方法。通常,椎间盘组织在20岁左右就开始发生退变,并且随着年龄的增长椎间盘退变越来越严重。尽管椎间盘退变的机制尚未阐明,目前的研究表明氧化应激诱导的髓核细胞凋亡在椎间盘退变中发挥着关键的作用。近年来,许多的研究发现椎间盘的衰老和退变与细胞凋亡引起的髓核细胞减少密切相关。椎间盘细胞虽然只占椎间盘体积分数的1%,但这些细胞能产生影响细胞外基质合成的因子,如Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白聚糖以及金属蛋白酶、前列腺素、一氧化氮等,这些因子在保持椎间盘的健康方面起着重要的作用。在健康的椎间盘,细胞外基质的合成和分解代谢若要保持动态平衡需依靠这些因子的调节。然而病理状态下,髓核细胞表型的变化以及数量的减少,髓核细胞不能使细胞外基质合成代谢与分解代谢保持平衡从而诱发椎间盘退变的病理学变化。目前研究发现细胞凋亡存在2条主要信号通路：内在的线粒体通路、外在的死亡受体信号通路。在线粒体通路中,当缺氧、缺血和活性氧等凋亡刺激因素作用下,可引起线粒体外膜的通透性增加,导致细胞色素c从线粒体释放入胞质,并与细胞凋亡激活因子1(Apaf-1)结合,并活化caspase-9前体,进而激活caspase-3,引发caspases级联反应,从而诱发细胞凋亡。越来越多的研究表明Bcl-2家族蛋白是在线粒体凋亡通路中起着重要调控作用的一类蛋白。Bcl-2家族蛋白按功能可分为促进和抑制细胞凋亡两大类成员：具有抑制凋亡作用的蛋白有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1等；具有促进凋亡作用的有Bax、Bcl-Xs、Bid等。在细胞凋亡中,Bcl-2家族促凋亡成员被激活,引起其构象改变,导致BH3结构域暴露,并转移到线粒体。Bax、Bad或Bid转移到线粒体后,可使线粒体跨膜电位降低及线粒体渗透性通透孔(PT)通道开放,引起线粒体内凋亡相关物质如细胞色素C等释放入胞质,引发下游的caspases级联反应,从而诱导细胞凋亡。胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内,死亡受体(death receptor, DR)是一组具有死亡结构域的膜受体,属肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因超家族成员。死亡受体可以接受胞外的死亡信号而激活细胞内的凋亡机制。胞外有一个富含半胱氨酸的结构域,膜内区有一段67-70个氨基酸序列,与细胞凋亡信号传递密切相关,有蛋白水解功能,称“死亡区域’’(Deathdomain, DD)。目前已知的死亡受体有Fas, TNFR-1, DR3, DR4和DR55种。Fas是细胞表面重要的死亡受体,细胞在接收到经Fas传递的凋亡信号后,可以经过两种条途径引发细胞程序性死亡。Fas Ⅰ型通路,Fas配体与Fas受体(FAS)结合导致强烈的caspase-8活化并且绕过线粒体直接又激活了凋亡执行酶caspase-3和caspase-7,接着进一步破坏细胞的细胞支架和修复蛋白,从而诱发细胞凋亡在Fas Ⅱ型信号通路,Fas受体介导的caspase-8的量不足以直接激活凋亡执行酶caspase-3。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体通路来放大,线粒体为启动下游的凋亡执行环节caspase级联反应提供放大信号。外源性和内源性凋亡途径最终都依赖caspase-3的激活,它是细胞凋亡的关键性执行分子,caspase-3一旦被激活,则细胞凋亡不可避免。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是产生氧化应激的重要根源之一,活性氧族包括括02-、OH-和H202等有害的中间产物。在正常情况下机体有一系列抗氧化防御体系：抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶等;非酶类分子,如硫氧还蛋白、谷胧甘肤和维生素A、C、E等。在正常机体组织细胞中,活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当机体内自由基的产生与抗氧化防御系统之间的平衡被打破,氧化程度超出氧化物的清除,将导致活性氧簇在体内或细胞内蓄积而引起细胞毒性从而引起组织损伤,称为氧化应激。当机体受氧化应激损伤时表现为组织脂质过氧化水平升高、引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常,造成细胞功能障碍,最终导致细胞死亡或凋亡。ROS可使细胞外基质退化,表现为抑制蛋白聚糖合成及破坏细胞外基质蛋白结构与蛋白酶活性。细胞内过量的ROS可作为第二信使触发凋亡信号,从而通过调节细胞凋亡相关基因的表达和核转录因子的活化,使细胞发生凋亡。目前许多研究发现,椎间盘内高水平的ROS会诱导髓核细胞的凋亡及加速细胞的衰老进而加速椎间盘的退变。线粒体不仅是是真核生物进行氧化代谢的部位,糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所,同时是产生ROS的主要场所,尤其在线粒体呼吸链复合物部位,其可诱导线粒体通透性转换孔的开放,致线粒体跨膜电位降低,使正常情况下存在于线粒体内外膜之间的凋亡相关蛋白将扩散至细胞质中,同时这又能正反馈使线粒体产生更多ROS。氧自由基可使线粒体DNA受攻击而损伤,损伤后很难修复。许多的研究表明,线粒体是细胞凋亡调控的活动中心,是凋亡的执行者。在细胞凋亡中线粒体损伤后的主要表现为：开启线粒体通透性转换孔释放凋亡酶激活因子激活caspase,如细胞色素C；线粒体跨膜电位(△Ψm)的丢失；线粒体氧化磷酸化功能障碍等,在这个凋亡过程中细胞色素C和caspase-3发挥了重要的作用。通过抑制椎间盘细胞凋亡来预防和治疗椎间盘退变是椎间盘疾病治疗的可能途径之一,若我们能在椎间盘退变早期调控椎间盘内ROS的水平,使髓核细胞免于氧化应激引起的损伤,将有可能为椎间盘退行性变提出新的策略。目前对氧化应激与线粒体凋亡信号通路在椎间盘退变的作用及关系尚未明确,因此揭示线粒体凋亡信号通路与氧化应激在椎间盘退变的作用及关系对椎间盘退变的治疗有着重大的意义。研究目的：体外构建大鼠髓核细胞氧化应激模型,探讨线粒体凋亡通路在氧化应激诱导髓核细胞凋亡中的作用及意义,为进一步预防和治疗椎间盘退变性疾病奠定实验和理论基础。研究方法：1、实验用SPF级雄性SD大鼠由南方医科大学动物实验中心提供,无菌条件下取出大鼠腰椎节段,解剖显微镜下尖刀切开椎间盘纤维环,用眼科镊夹取胶冻样髓核组织。采用胰酶/胶原酶消化法原代培养大鼠髓核细胞,运用免疫组化染色,免疫荧光检测对髓核细胞进行鉴定。2、以不同浓度过氧化氢(H202)作用于髓核细胞制造氧化应激模型；将生长良好的第3代髓核细胞制成细胞悬液,按5000个/孔接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后,融合达80%-90%时,换无血清DMEM-F12培养液继续培养24h,使细胞处于静止期。对照组不给予H2O2处理,实验组用50,100,200,400μmol/LH202处理6h。 CCK8法检测各组细胞的存活率。3、细胞凋亡率检测：对照组不给予H202处理,实验组取两个浓度组(100μmol/L,200μmol/L H202处理6h。Hoechst33258染色以及Annexin V/PI流式细胞术检测各组细胞凋亡率。4、DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内ROS含量、JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位的变化。5、免疫印迹(Western blot)法检测凋亡相关蛋白(细胞色素C,Bax, Bcl-2,caspase-3)的变化。6、所有统计分析均通过SPSS13.0统计软件完成。数据均用均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著差异法(least significant difference, LSD)方法检验,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果：1、原代培育的细胞呈类呈多角形、纺锤形或梭形,达亚融合状态后呈漩涡状或火焰状的细胞团,胞质丰富,具有折光性,有一个较大的卵圆形核,轮廓清晰。Ⅱ型胶原免疫组化、免疫荧光染色均可见阳性表达,因此可鉴定此细胞为髓核细胞。2、CCK8法检测结果显示H2O2对髓核细胞的生长具有明显的抑制作用,随着浓度的升高,细胞生存率降低,呈浓度依赖关系,各浓度组细胞生存率与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测各组细胞凋亡结果显示,随着H202浓度升高细胞凋亡比例增加,100μmol/L H2O2细胞凋亡率为(22.43±2.66)%,200μmol/L H2O2细胞凋亡率为(32.5±2.22)%,均较对照组明(5.3±1.87)%明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。3、与对照组相比,实验组大鼠髓核细胞受H202诱导后细胞内活性氧水平增加,线粒体跨膜电位下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)4、Western blot检测显示实验组细胞经H202诱导后Bcl-2蛋白表达降低,而胞浆细胞色素C、Bax、活化型caspase-3升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)研究结论：1、过氧化氢可诱导体外培养的大鼠髓核细胞发生凋亡；2、过氧化氢诱导大鼠髓核细胞凋亡过程中,可使细胞内ROS升高且线粒体膜电位降低,最终激活线粒体依赖的凋亡通路,引起髓核细胞凋亡；3、线粒体凋亡通路在氧化应激诱导大鼠髓核细胞凋亡过程中起重要作用,抑制线粒体凋亡通路及降低椎间盘细胞内ROS的水平可能为椎间盘退变性疾病的治疗提供新策略。