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颅脑损伤是当今威胁人类生命的主要疾患之一,其发生率和死亡率仅次于癌症和心血管疾病而居第三位,在暴力性死亡中颅脑损伤的死亡率居首位。研究颅脑损伤的发生发展机制及其治疗措施,有着十分重要的意义。颅脑损伤后一个非常重要的继发性损伤就是神经细胞凋亡,而脑损伤后氧自由基的大量释放和caspase-3的激活是诱发凋亡的关键步骤。本研究采用改进的Feeney自由落体大鼠颅脑损伤模型,观察使用特异性caspase-3抑制剂后,对神经细胞凋亡的作用和对体内氧自由基水平的影响。为临床开发新药提供线索,并为进一步探讨caspase-3在凋亡中的可能机制提供思路和证据。 材料与方法 采用健康雄性SD大鼠36只,体重300±15g,由浙江大学医学院实验动物中心提供,随机分为假手术组、生理盐水注射对照组、z-DEVD-fmk治疗组,各组依次为12只、12只、12只。所有大鼠均经盐酸氯氨酮(40mg/kg)腹腔注射麻醉后,置于立体定位仪上,固定头部,额顶部去毛,头皮碘酒、酒精消毒,矢状切开头皮,暴露右顶骨,用牙科磨钻在冠状缝后2mm,中线旁2mm处钻一直径4~5mm骨窗。在同一骨窗里,用与25μl微量注射器连接的穿刺针穿刺右侧脑室,坐标:AP1mm,LAT1.5mm,DEP4.5mm,灌注速度为2μl/min,NS对照组灌注生理盐水10μl,caspase-3抑制剂组注z-DEVD-fmk 10μl(0.5μg/μl),留针10min。30min后,采用改进的Feeney自由落体损伤装置进行打击,用50g重的击锤从16cm处自由浙江大学硕七研究生学位论文坠落冲击撞杆造成严重的脑挫裂伤,打击深度3rnrn,硬膜保持完整。30min后,同一坐标,NS对照组灌注生理盐水1印l,caspase一3抑制剂组注z一DEVD一fmk 10川(0 .5件留闪),留针10min。拔针后用脑耳胶封闭硬膜针眼,骨窗用牙托粉封闭,缝合头皮。假手术组,开骨窗后,骨窗用牙托粉封闭,缝合头皮。所有大鼠均于伤前0小时,抗凝,伤后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时断尾取血0.lml,肝素钠采用黄喋吟氧化酶法测红细胞SOD,红细胞MDA值;所有大鼠72小时后氯氨酮硫代巴比妥酸反应产物比色分析法测(4Om叭g)腹腔注射麻醉,断头处死,在冰盘上快速取全脑,00c PBs缓冲液清洗,滤纸吸干。沿冠状切面,将脑切为2~脑片。将一含损伤区脑片用福尔马林液固定,做HE染色及以TU]写EL法观察凋亡。取损伤周围1~左右,粟米大小,2.5%戊二醛固定,送电镜检查。 结果一、HE染色及电镜观察 72小时后,在外伤中心区可见大量炎症细胞侵润,神经细胞染色较淡,出现细胞肿胀、胞核碎裂、溶解等细胞坏死特征,生理盐水对照组和治疗组差别不大。损伤周围区神经细胞数量减少,出现体积缩小,细胞间隙增宽,细胞核固缩,染色质浓缩、边聚等细胞凋亡的特征,少量细胞出现坏死,生理盐水注射对照组相对于治疗组较为明显。假手术组很少见到上述变化,以正常细胞为主。二、TUNEL法神经细胞染色 72小时后,假手术组神经细胞TUNEL阳性细胞率很低;在损伤周围区域,生理盐水注射对照组阳性细胞率明显增加(尸<0.01);z一DEVD币nk治疗组在同区域中TUNEL染色阳性细胞数比对照组明显下降,有非常显著意义(P<0.01);但比假手术组依然增高明显(尸<0.01)。三、组间同时段SOD和MDA平均值(社s)比较 在6小时、12小时、24小时、48小时和72小时,假手术组、生理盐水注射对照组和z一DEVD币刀k治疗组三组间红细胞SOD值和MDA值比较:对照组和假手术组,治疗组和假手术组都有非常显著性差异(P<0.01),而对照组和治疗组之间只有SOD组在6小时有显著性差异(尸<0.05),其它都没有显著性差异(P>0.05)。万门 浙江大学硕士研究生学位论文四、组内各时段红细胞SOD和MDA平均值(社s)比较 假手术组红细胞SOD值和MDA值随时间变化没有规律;生理盐水注射对照组和z一DEVD毛nk治疗组红细胞SOD值随时间先降低,在48小时左右到达最低值,然后有不同程度的升高,在72小时仍然明显低于假手术组;生理盐水对照组和z一DEVD币nk治疗组红细胞MDA值随时间先升高,在48小时左右达到最高点,然后有不同程度的降低,在72小时仍然明显高于假手术组。 结论 1、大鼠脑损伤后在损伤周围区存在大量神经细胞凋亡。使用z一DEVD币nk特异性抑制casPase一3活性以后,能减少凋亡,起到脑保护作用。 2、大鼠脑损伤后,氧自由基在体内大量表达;使用补DEVD.nnk特异性抑制casPase一3活性后,不能减少体内氧自由基的水平。