目的在世界范围内心血管疾病仍然在影响死亡率的疾病中排在首位。随着医疗技术水平的提高，各种心脏疾病，尤其是心肌梗死的死亡率显著下降，但无论是各种药物，溶栓还是介入治疗，所能达到的仅仅是挽救濒临死亡的心肌，防止梗死心肌的面积进一步扩大，而对已经死亡的心肌没有影响。因此，很多学者致力于干细胞修复受损心肌或心肌再生的研究。Orlic等报道，小鼠心肌梗死后局部注射至梗死边缘区的骨髓干细胞或应用细胞因子进行骨髓动员可以促进心肌再生，心功能也有相应的显著改善。但没有其他研究组重复出相同的结果，因而对心肌再生的问题目前仍存在很大争议。此外，局部组织的微环境对细胞分化的作用至关重要，如果心肌梗死后成体干细胞能够定植入梗死的心肌，其主体能否向着成纤维细胞方向分化并促进心肌纤维化，这一点迄今为止尚无报道。还有实验提示再生的心肌细胞具有致心律失常的可能性。当前，干细胞心肌再生治疗心肌梗死及其它心肌疾病的临床试验具有广泛开展的趋势，而一系列有关心肌再生的基本问题尚不清楚。本实验应用骨髓移植后小鼠的心肌梗死模型，采用G-CSF和SCF进行骨髓动员的方法刺激骨髓干细胞入血并定植入缺血或梗死部位心肌，观察骨髓干细胞在心脏内的分化及骨髓动员对心肌电生理的影响，并分析可能的机制。材料与方法1、实验动物：12-16周龄雄性野生型CD1小鼠（Charles River GermanyGmbH）90只体重32-45克。6-8周龄雌性C57／BL6小鼠60只，20-26克。骨髓移植所用骨髓的供体为在以C57／BL6为背景的增强绿色荧光蛋白（EGFP）转基因小鼠。将CD1小鼠和C57／BL6小鼠分别随机分为2组：骨髓动员组及对照组。2、脾切除、骨髓动员、骨髓移植及建立心肌梗死模型：在小鼠进行骨髓动员或骨髓移植至少2周以前行脾切除术。此后，骨髓动员组的CD1小鼠被连续6天予以皮下注射重组鼠的SCF和rh G-CSF。而C57／BL6小鼠在脾切除2周后行骨髓移植。骨髓细胞收集自4-6周龄的C57／BL6种系EGFP转基因小鼠股骨的骨髓。至少8周后行骨髓动员。在骨髓动员的第三天，2组小鼠均行冠状动脉前降支近端结扎，建立心肌梗死模型。3、心脏超声及体表心电图纪录：小鼠心肌梗死前及3周后予以心脏超声及12导联心电图检查评价心功能及梗死部位及范围。左室功能及室壁运动情况用M超模式在心尖，乳头肌和心底水平的左室短轴缩短率来评价，以左室长轴及短轴切面上的室壁运动障碍的范围来估测心肌的梗死面积，记录经主动脉瓣的血流多普勒信号以估测小鼠心脏的每搏输出量。4、离体灌流心脏的电生理检查：小鼠心脏被迅速摘取，游离主动脉后插管并连接至Langendorff离体心脏灌流装置上。用电生理导管进行右心房及右心室准备起搏，以测量稳定状态下心肌的动作电位时程。以Ag-AgCl电极纪录心外膜电图，同时连续纪录三组单相动作电位，其中一个MAP电极置于梗死的边缘区用来记录后除极电位。3毫克腺苷加入灌流液中阻断房室结后观察其室性自主心律10分钟。然后，为测试心室折返的可能性，对其实施心室程序刺激：S₁S₂或S₁S₂S₃刺激，起搏周期80-140 ms，观察刺激过程中有无室性心动过速的发生。5、组织学及免疫荧光技术：当心电生理检查结束之后，将小鼠心脏投入3．7％福尔马林溶液中或Bouin溶液中固定，此后进行石蜡包埋（CD-1小鼠）或以O．C．T．复合物于液氮中包埋（C57／BL6小鼠）。石蜡标本与冰冻标本分别连续切片，厚度为7μm或10μm，然后分别进行Goldner’s trichrome染色或免疫荧光染色。已行免疫荧光染色的切片一周内在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并在40℃冰箱中避光保存。为了确定心脏中不同骨髓细胞分化的细胞群的数量，我们在心肌梗死区，梗死边缘区及非缺血区三个区域分别随机取3个高倍视野（400×）计数EGFP阳性细胞以及与EGFP在同一细胞共同表达的细胞标记抗原阳性细胞（以抗CD45抗体标记白细胞，以抗β-MHC、抗肌钙蛋白T抗体、抗α-辅机动蛋白标记心肌细胞，以抗CD31抗体及vWF抗体标记血管内皮细胞，以抗平滑肌α-肌动蛋白标记血管平滑肌细胞，以抗成纤维细胞抗血清标记成纤维细胞）。6、统计学分析所有数据均以均数±标准误（（?）±SEM）表示。样本均数间的比较采用非配对t检验或one way ANOVA检验。计数资料采用χ²检验和log rank检验。p<0．05为差异有显著性。结果1．骨髓动员对小鼠心肌梗死后死亡率的影响：被随机分为骨髓动员组和对照组并且存活到冠脉结扎前的小鼠共124只，冠脉结扎后小鼠死亡70只，均于手术后24小时内死亡，总死亡率56．45％。其中CD（?）1小鼠骨髓动员组和对照组死亡率分别为51．16％，51．61％，C57／BL6小鼠骨髓动员组和对照组死亡率分别为82．61％，48．15％，P<0．05。2．骨髓动员对梗死心肌的范围及血流动力学的影响：结扎冠状动脉前降支导致心脏超声检查所见的前壁心肌局部运动异常，左室短轴缩短率下降，典型的前壁心肌梗死的心电图表现，以及组织学检查可见左室部分心肌被纤维瘢痕组织所代替。小鼠心脏的梗死范围、左室收缩力在骨髓动员组和对照组之间没有统计学差异。骨髓动员组小鼠的心输出量明显高于对照组。3．骨髓干细胞在小鼠的梗死心脏中的定位及分化：发现绝大多数的骨髓来源的细胞（EGFP阳性细胞）定位于心脏的梗死区或边缘区。与对照组相比，骨髓动员可以增加EGFP阳性细胞在心脏中边缘区和梗死区的定位（P<0．05）。约99％的心脏中的EGFP阳性细胞都同时表达CD45，提示它们为白细胞。在梗死区或边缘区每组仅发现有极少数（1至3个）新分化来的心肌样细胞；而在非缺血区，可以发现由骨髓干细胞分化而来的心肌细胞（0．1至5个细胞／切片）。仅有少量的新分化而来成纤维细胞及极少数的血管内皮细胞定位于梗死心脏的非缺血区，在心肌切片中未能发现新分化的血管平滑肌细胞。4．骨髓动员对心肌电稳定性的影响：心脏房室结阻断后，后除极电位诱发的自发性心律失常发生率在骨髓动员组和对照组之间没有区别。并且，在骨髓动员组小鼠中没有记录到延长的动作电位时程。通过心室程序刺激，在骨髓动员组小鼠心脏程序刺激诱发室性心动过速的发生率明显低于对照组：S₁S₂刺激诱发室速在骨髓动员组为44％（11／25），对照组为69％（18／26）；S₁S₂S₃刺激诱发室速在骨髓动员组为71％（5／7），对照组为100％（8／8）（p<0．05）。另外发现，短心动周期（100 ms）S₁S₁刺激时骨髓动员组小鼠心肌的动作电位时程明显较对照组小鼠缩短。讨论在小鼠心肌梗死模型中，骨髓动员可以增加骨髓来源的细胞定植入梗死心肌中，但绝大多数在梗死或非梗死心肌内定植并分化的细胞为白细胞，仅有极少数分化为心肌细胞或类心肌细胞以及血管内皮细胞。尽管心肌梗死部位的主要细胞成分是成纤维细胞，但从免疫荧光染色的结果可以判断，它们的来源并非骨髓干细胞，而仅有极少数的位于非缺血心肌间质成纤维细胞可能有骨髓干细胞分化而来，提示在小鼠心肌梗死模型中，骨髓干细胞未参与梗死区疤痕形成的病理过程。除了白细胞以外，在心脏的梗死区很少能发现的新分化而来的其他种类的细胞，提示了某种可能性，即在梗死区可能会由于缺乏血液供应而影响干细胞的分化能力甚或影响干细胞的存活能力。虽然在本实验中骨髓动员或骨髓干细胞几乎不能促进心肌再生，但骨髓动员能够在某种程度上改善心脏功能，增加心输出量。我们使用了阻断房室结的方法以达到诱发后除极电位的目的，发现在骨髓动员组小鼠中并没有自发性心律失常或后除极电位增加的倾向。而室性心律失常的可诱发性降低以及动作电位时程缩短提示在心肌梗死后增多的骨髓来源细胞（BMDCs）定植于心脏可能具有某种抗心律失常作用，至少不增加室性心律失常的发生率。这与一些临床试验报告的冠脉内注射BMCs治疗心肌梗死患者不增加心律失常的发生率的临床结果相一致。在实验中发现，与对照组相比，骨髓动员可以增加C57／BL6小鼠的死亡率；而在两组CD（?）1小鼠间差异无显著性。可能的原因在于C57／BL6小鼠经历了更多的创伤，尤其是致死量的⁶⁰钴γ-射线照射，导致它们机体的状态及承受能力较差。而连续的骨髓动员后，大量的包括巨噬细胞在内的血细胞及其祖细胞持续释放入血，单位容积的血液内血细胞的浓度明显增加，可能会引起肺微循环的障碍。另外，从试验结果可以得出结论，即骨髓动员可以增加白细胞在心肌梗死区的渗出，加剧梗死部位原本存在的炎症反应也可能是骨髓动员组小鼠死亡率明显增加的原因之一。近期的一项临床试验发现，利用G-CSF进行骨髓动员提取造血干细胞在冠脉介入治疗后经冠脉注入心肌可以改善心功能，但骨髓动员同时导致冠脉介入治疗后血管再狭窄的发生率增加。结合本实验中骨髓动员促进心肌梗死后C57／BL6小鼠死亡率增加的发现，提示利用骨髓动员进行心肌再生或心功能不全的临床试验应慎重开展。结论1．应用G-CSF和SCF动员骨髓能够明显促进骨髓来源细胞定植入小鼠心脏的梗死区，但绝大多数为白细胞；且骨髓动员在一定条件下增加心肌梗死小鼠围手术期的死亡率。2．利用骨髓动员的方法，仅有极少数骨髓干细胞可以分化为心肌细胞，其数量远不足以修复梗死心肌，对心功能也不产生明显的影响。3．骨髓干细胞可以在小鼠心脏的非梗死区分化为血管内皮细胞及成纤维细胞，但不参与梗死区疤痕形成的病理过程。4．应用细胞因子进行骨髓动员不增加心肌梗死小鼠室性心律失常的发生率，并可以减少折返机制相关的室性心动过速。