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研究目的本实验旨在研究人类miR-218在结肠癌中的表达,并且探讨miR-218所调控的靶基因,以阐明其在结肠癌的预后判断以及辅助诊断中的作用。研究方法分别取南华大学附属第二医院病理科2007-2009年间石蜡包埋结肠癌组织58例及相应的癌旁正常结肠组织标本,和2009-2010年间术后结肠癌组织及相应的癌旁组织20例,将癌旁正常结肠组织作为对照,结肠癌组织为实验组。应用原位杂交及qRT-PCR检测两组标本中miR-218的表达水平,并分析miR-218表达与结肠癌临床分期及淋巴结转移之间的关系;通过生物信息学预测miR-218调控的靶基因,选取包含miR-218结合位点的Sp1 3’UTR片段序列(公司合成)插入报告质粒;为证明确实是miR-218作用该结合位点导致荧光素酶活性发生改变,同时设计3’UTR缺失miRNA-218结合位点的突变序列(公司合成)插入报告质粒;将miR-218 mimics与pMIR-REPORT/Sp1 UTR质粒共转染HEK293T细胞,进行荧光素酶活性检测;将miR-218 mimcs或Negative control转染结肠癌SW620细胞,分别抽提细胞总RNA及蛋白,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-218对Sp1表达的影响。研究结果原位杂交结果表明,58例结肠癌组织中miR-218阳性表达9例,阳性率为15.52%,58例癌旁对照组织中miR-218阳性表达52例,阳性率为89.66%,结肠癌组织中miR-218表达明显低于对照癌旁组织,二者差异有统计学意义(P<0.05), miR-218的表达随着结肠癌临床分期演进而降低,临床Ⅲ/Ⅳ期、Ⅰ/Ⅱ期结肠癌癌旁对照组光密度值分别为0.16±0.02、0.39±0.05、0.52±0.09,临床Ⅲ/Ⅳ期明显低于Ⅰ/Ⅱ期结肠癌(P<0.05);有淋巴结转移的结肠癌miR-218的表达明显低于无淋巴结转移(光密度值分别为0.26±0.03、0.59±0.07, P<0.05),因此,miR-218与结肠癌临床进展及转移呈负相关。同样,qRT-PCR结果显示miR-218在结肠癌组织中表达明显低于癌旁组织(P<0.05)。通过在线软件预测miR-218潜在靶基因,其中通过targetscan预测到699个潜在靶基因,通过pictar预测到551个潜在靶基因,Sp1是这两个软件预测到的共同的靶基因。荧光素酶活性检测结果显示: miR-218 mimics对空白报告质粒组和pMIR-REPORT/UTR突变型荧光素酶活性强度无明显影响,但在miR-218 mimics与pMIR-REPORT/UTR野生型质粒共转染细胞后荧光素酶活性下降了约55%(图12),有统计学差异(P<0.05)。荧光素酶活性分析系统验证结果表明:miR-218能与Sp1 3’UTR结合。过表达miR-218能明显下调Sp1蛋白表达水平但Sp1 mRNA水平无明显影响,表明miR-218能在翻译水平靶向调控Sp1的表达。结论1、miR-218在结肠癌中表达下调,可能其表达越低患者预后越差;2、Sp1是miR-218调控的下游靶基因;3、miR-218通过抑制Sp1的表达,可能起到抑制结肠癌的发生及转移的作用。