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研究背景本课题的目的是研究新型第三代光敏剂---四磺酸基酞菁锌(ZnPcS4)与牛血清白蛋白(BSA)的配合物(ZnPcS4-BSA)对U251人脑胶质瘤的体外和体内光动力效应,为其在临床应用提供前期基础研究。胶质瘤是神经外科最常见的恶性肿瘤,其发病率、死亡率都非常高,预后很差。目前其治疗主要以手术+化疗+放疗为主,但疗效均不理想。寻找更有效的胶质瘤治疗方法,一直是世界各国医疗工作者和科研人员努力的方向。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种新型的医疗技术,对它的临床研究始于20世纪70年代,目前有很多种良恶性疾病的治疗都运用到了PDT这一手段,疗效也让人相当满意。这种方法也被应用到脑胶质瘤的治疗当中,但疗效有待进一步观察和大样本、长期随访研究。在胶质瘤的光动力治疗中,光敏剂起着一个举足轻重的作用,不同的光敏剂治疗效果和不良反应有很大的差异。第一代的光敏剂的组成不定,都是比较复杂的卟啉混合物,结构尚未完全确定;其最长激发波长在630nm,作用光谱不理想,因为此波长的组织穿透能力较差,其作用深度少于0.5 cm,对治疗大而深的肿瘤不理想;给药至光照时间隔长;在体内的滞留时间长,避光时间需4周以上,皮肤光敏副作用大。第二代光敏剂较第一代的有很大改善,但仍存在光敏剂在肿瘤组织中的选择性和富集能力有限的缺点。本研究采用的是第三代光敏剂ZnPcS4-BSA,其激发波长更接近红光,作用时间短,代谢更快,靶向性更强。该光敏剂对胶质瘤的光动力治疗效果如何,目前还没有人研究。基于此,本研究使用ZnPcS4-BSA对U251人脑胶质瘤作了体外和体内的研究,并对其作用机制进行了探讨。本研究分为两个部分,第一部分主要研究ZnPcS4-BSA对U251人神经胶质瘤细胞的体外光动力杀伤效应,探索该光敏剂的最佳用药浓度、最佳用药时间和最佳激光剂量,并对其杀伤机制进行探讨;第二部分主要是根据第一部分的实验结果,进一步研究ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠的体内光动力杀伤效应,并对其杀伤机制进行分析。第一部分:新型光敏剂ZnPcS4-BSA对U251人神经胶质瘤细胞体外光动力杀伤效应及其机制研究目的:通过探讨四磺酸基酞菁锌(ZnPcS4)与牛血清白蛋白(BSA)的配合物(ZnPcS4-BSA)介导的光动力疗法(PDT)对体外培养的U251人神经胶质瘤细胞的光敏化作用,探索该光敏剂的最佳用药浓度、最佳用药时间和最佳激光剂量,并对其杀伤机制进行探讨,为进一步研究(ZnPcS4-BSA)应用于动物体内,及将来运用于临床胶质瘤的治疗提供实验数据与理论基础。方法:1.常规方法复苏、传代培养U251人脑胶质瘤细胞2. ZnPcS4-BSA的摄取规律紫外可见光分光光度计扫描ZnPcS4-BSA吸收峰值,并根据该峰值做浓度标准曲线;检测U251细胞内ZnPcS4-BSA的含量。得出ZnPcS4-BSA作用于U251细胞的最佳孵育时间。3. ZnPcS4-BSA本身对U251人脑胶质瘤细胞的细胞毒性作用分组:阴性对照组:不加ZnPcS4-BSA,只加生理盐水,8组不同浓度光敏剂组:浓度分别为0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μmol/L处理:均不光照。CCK-8法测定细胞存活率。4.单用激光辐射对细胞的毒性5组U251细胞用剂量分别为25、50、100、200、400 J/cm2的激光照射,各组均不加光敏剂,CCK-8法测定细胞存活率。5.激光剂量对ZnPcS4-BSA介导PDT对细胞杀伤力的影响5组U251细胞均加入浓度为30μmol/L的ZnPcS4-BSA,孵育4h后,用剂量分别为25、50、100、150、200J/cm2的激光照射。CCK-8法测定细胞存活率。得出ZnPcS4-BSA介导PDT的最佳激光能量。6. ZnPcS4-BSA浓度对其介导PDT的影响分组:阴性对照组:不加ZnPcS4-BSA,无激光辐射培养的U251。5组不同浓度光敏剂组:浓度为20、40、60、80、100μmol/L,继续培养4h后,给予激光剂量为150 J/cm2辐射。处理:使用CCK-8法检测各组细胞存活率,并计算抑制率。得出ZnPcS4-BSA介导PDT的最佳ZnPcS4-BSA浓度。7.流式细胞术检测细胞凋亡取20μmol/L的ZnPcS4-BSA,100 J/cm2辐射组细胞进行凋亡检测实验,以同样条件培养而未作PDT治疗细胞作为对照。流式细胞仪上机检测,WinMDI29软件分析凋亡8. Real-Time PCR检测VEGF基因表达取20μmol/L的ZnPcS4-BSA,100 J/cm2辐射组细胞进行VEGF基因检测,以同样条件培养而未作PDT治疗细胞作为对照。用荧光定量PCR仪、cDNA合成试剂盒与All-in-OneTM qPCR Mix检测VEGF基因表达。9.数据资料采用SPSS17.0软件包进行统计分析。结果以均数±标准差表示,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.U251人脑胶质瘤细胞经复苏多次传代生长良好,具有恶性胶质瘤的病理形态特征;2.紫外扫描发现ZnPcS4-BSA于684nm处有吸收波峰,并制作标准曲线,相关系数r=0.999,P<0.001,说明曲线拟合良好。并且U251人脑胶质瘤细胞与ZnPcS4-BSA孵育4h后摄取ZnPcS4-BSA的量达到峰值。3.单用不同浓度ZnPcS4-BSA处理细胞而不给激光辐射,各组间的细胞生存率差异没有显著性意义。4.在U251人脑胶质瘤细胞的培养中不加入ZnPcS4-BSA,而单纯给予不同剂量的激光辐射,不同剂量组的细胞存活率经各组间LSD分析发现最高剂量组(400 J/cm2)细胞生存率低于其他各组(P<0.001),其他各组比较无统计学差异。5.固定光敏剂浓度为30μmol/L,分别给予不同剂量激光照射,随着激光剂量的增加,细胞生存率降低。6.固定激光剂量为200 J/cm2,给予不同浓度ZnPcS4-BSA进行光动力反应。随着光敏剂浓度增加,细胞抑制率增加,IC50为0.16mmol/L7.流式细胞术检测细胞凋亡,发现与未处理组相比,PDT组凋亡比率升高,有显著差异(P<0.01)。光镜下见肿瘤细胞数量大幅减少,残留肿瘤细胞失去正常形态,胞体皱缩,胞浆颜色变浅,细胞核固缩,培养皿内杂质增多。8.经过PDT组的U251人脑胶质瘤细胞VEGF基因表达是未处理组的5.29倍,有显著性差异(P<0.05)。结论:1. ZnPcS4-BSA介导的对U251人脑胶质瘤细胞的光动力学治疗的最佳时间应该是用药后4小时。2. ZnPcS4-BSA本身对U251人脑胶质瘤细胞没有明显毒性作用。3.在低于200 J/cm2激光剂量范围内,单纯激光辐射不会损伤U251人脑胶质瘤细胞,过高剂量激光则会杀伤U251人脑胶质瘤细胞。4.在ZnPcS4-BSA介导的对U251人脑胶质瘤细胞的光动力治疗中,最佳的激光剂量为200 J/cm2。5.在ZnPcS4-BSA介导的对U251人脑胶质瘤细胞的光动力治疗中,随着ZnPcS4-BSA浓度增加,U251人脑胶质瘤细胞的抑制率增加。半数抑制浓度IC50为0.16mmol/L。6. ZnPcS4-BSA介导的PDT能通过诱导凋亡产生肿瘤治疗作用。7. ZnPcS4-BSA介导的PDT能诱导VEGF基因表达增加。第二部分:新型光敏剂ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠的体内光动力杀伤效应及其机制研究目的:建立U251人脑胶质瘤裸鼠模型,探讨新型光敏剂ZnPcS4-BSA介导的光动力疗法对胶质瘤的体内光动力杀伤效应,并分析其对胶质瘤的杀伤机制,为其将来的临床应用奠定理论基础。方法:1.将U251人脑胶质瘤细胞株按常规传代、培养,将含有1×108个U251人脑胶质瘤细胞的悬液0.2m1接种于裸鼠左侧腋部皮下,接种后继续于SPF条件下饲养,当肿瘤直径长至0.6-0.8cm时,开始进行实验。2.30只裸鼠随机平均分成5组,荷瘤对照组不作任何处理;单纯光照组只给波长为670nm、剂量为200 J/cm2激光照射;单纯光敏剂组):只尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为2mg/kg,不光照,避光24小时;低剂量光动力组):尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为1 mg/kg,避光4小时后,用波长为670nm、剂量为200 J/cm2的激光照射,再避光20小时;高剂量光动力组):尾静脉注射光敏剂ZnPcS4-BSA,剂量为2 mg/kg,避光4小时后,用波长为670nnm、剂量为200 J/cm2的激光照射,再避光20小时。每周重复1次,连续3次后处死裸鼠,切除肿瘤,测量瘤体体积和瘤重,计算抑瘤率。各组肿瘤标本HE染色,光镜下观察。3.免疫组化测定不同组别肿瘤组织的VEGF表达,光镜下观察VEGF表达阳性的细胞并计数。4.光镜下检测平均血管密度(MVD)并计数。5. TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数,光镜下观察。6.数据采用SPSS17.0软件包进行统计分析。结果以均数±标准差表示,各组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.动物模型成功建立,成瘤率100%。2.荷瘤对照组和单纯光照组、单纯光敏剂组的肿瘤体积相比,无统计学意义(P>0.05);高剂量PDT组和低剂量PDT组肿瘤体积与荷瘤对照组比较有统计学差异(P≤0.05)。荷瘤对照组和单纯光照组、单纯光敏剂组的瘤重相比,无统计学意义(P>0.05);高剂量PDT组和低剂量PDT组的肿瘤瘤重与荷瘤对照组比较,有显著性差异(P≤0.05)。低剂量PDT组和高剂量PDT组的抑瘤率分别为57.488%和67.150%,显著高于单纯光照组合单纯光敏剂组。3.PDT治疗后光镜下见肿瘤细胞生长密度降低,胞体体积变小,胞核固缩,坏死多见。4.与荷瘤组比,单纯光照组和单纯光敏剂组的VEGF和MVD表达差异均无统计学差异,低剂量PDT组和高剂量PDT组与对照组的VEGF和MVD表达比较均有统计学意义,低剂量PDT组和高剂量PDT组之间VEGF与MVD表达的比较有统计学意义。MVD水平随着VEGF表达的增强而增加,其相关系数为r=0.999,P<0.001。5.单纯光照组、单纯光敏剂组和荷瘤对照组凋亡指数比较无统计学差异接近(P>0.05);高低剂量PDT组与荷瘤对照组比较有显著差异(P≤0.05),高剂量PDT组和低剂量PDT组比较有统计学差异(P≤0.05)。光镜下见PDT后出现较多的凋亡细胞。结论:1.在光敏剂ZnPcS4-BSA对U251人脑胶质瘤的体内PDT中,可以成功制出裸鼠人脑胶质瘤移植瘤的模型。2.光敏剂ZnPcS4-BSA本身无能量辐射时不会被激活发生光动力反应,产生细胞毒作用;单纯给予荷瘤裸鼠激光照射无法抑制肿瘤生长;单纯光敏剂ZnPcS4-BSA对荷瘤裸鼠没有明显毒性作用;在一定范围内,光敏剂ZnPcS4-BSA的PDT抑瘤效果随着光敏剂剂量的增加而增强。3.光敏剂ZnPcS4-BSA在PDT后肿瘤组织中VEGF表达在PDT后升高,其机制可能与PDT引发缺氧有关。在U251人脑胶质瘤新生血管形成中随着VEGF表达的增强,MVD也逐渐增加。4.在光敏剂ZnPcS4-BSA对荷U251人脑胶质瘤裸鼠的PDT中,存在诱导肿瘤细胞凋亡这一机制。