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[研究背景]LRRC4是与胶质瘤密切相关的脑组织特异性抑瘤基因,在胶质瘤组织和细胞中表达下调或缺失,LRRC4启动子甲基化修饰是其失活的重要分子机制之一。外源性过表达LRRC4可抑制胶质瘤细胞生长,使胶质瘤细胞周期阻滞于G0/G1期,LRRC4可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信号通路抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,能与靶基因的3’UTR区碱基不完全或完全配对,并在转录后水平抑制蛋白的翻译过程,甚至直接降解RNA而发挥负调控靶基因表达的作用。本课题用前期构建的外源性LRRC4表达的稳定转染胶质瘤细胞系U251/LRRC4和对照细胞系U251/Control,进行miRNA芯片分析,筛选受LRRC4调控的差异miRNA,从miRNA的角度探讨LRRC4在胶质瘤中的抑瘤作用。[LRRC4调控的显著差异miRNA的GO分析及其在胶质瘤中的预后分析]miRNA芯片结果经qRT-PCR证实发现过表达LRRC4后下调2倍以上的miRNA4个(miR-182, miR-381, miR-15b, miR-487b),上调2倍以上的miRNA3个(miR-185, miR-155, miR-612)。通过LRRC4所调控miRNA的预测靶基因功能显著性分析,构建了以LRRC4为核心的LRRC4-miRNA-靶基因调控网络图,从该图可以看出：LRRC4可以调控多个rniRNA的表达,一个rniRNA也可以调控多个靶基因的表达；而一个靶基因的表达也可以受多个rniRNA的调控。有趣的是rniRNA (miR-182、miR-381、miR-590-3p)和核心靶基因(LRRC4)之间存在着相互调控的关系。通过LRRC4调控的显著差异的miRNA(miR-182、 miR-381和niR-185)在胶质瘤细胞和组织中的表达发现,与正常脑组织相比,miR-182(?)(?) miR-381在胶质瘤组织和细胞中均呈现高表达,且miR-182或miR-381表达越高,患者预后越差,而miR-185在胶质瘤组织和细胞中显著下调,其表达越低,患者预后越差。[miR-182或miR-381是胶质瘤治疗的潜在生物靶点,干扰miR-182或rniR-381可通过调控靶基因LRRC4的表达,抑制BRD7(?)勺转录而抑制胶质瘤细胞的生长。其中,LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4调控环路在胶质瘤的发生发展中发挥了重要的作用]miRNA可以发挥瘤基因的作用参与胶质瘤细胞的增殖和生长。细胞和裸鼠皮下移植瘤实验表明,miR-182或miR-381可促进胶质瘤细胞生长,因此,miR-182或miR-381是胶质瘤治疗的潜在生物靶点。干扰miR-182或rniR-381通过上调磷酸化Rb、降低E2F3的表达将胶质瘤细胞阻滞于G0/G1期,抑制胶质瘤细胞生长。LRRC4作为胶质瘤抑瘤基因是miR-182和miR-381共同调控的靶基因。我们的研究发现,miR-182, miR-381和BRD7均与LRRC4在正常脑组织及胶质瘤组织中的表达呈负相关。干扰miR-182或miR-381可通过上调靶基因LRRC4的表达,抑制LRRC4介导的ERK/MAPK和PI-3K/AKT信号通路调控AP-2/SP1/E2F6/C-Myc等转录因子与BRD7基因的结合,从而抑制BRD7的转录和表达,上调磷酸化Rb和下调E2F3的表达,将细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制胶质瘤细胞的生长,并诱导胶质瘤细胞向胶质样细胞分化。生物信息学预测并通过ChIP等实验证实转录因子AP-2正性调控miR-182的转录,结合前面证实在胶质瘤中miR-182抑制靶基因LRRC4的表达,LRRC4又可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信号通路抑制转录因子AP-2的表达及转录活性,因此,在LRRC4, miR-182, AP-2之间形成了LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4调控环路参与胶质瘤的发生发展。[miR-185通过抑制靶基因DNMT1调控全基因组甲基化水平,恢复LRRC4等高甲基化基因在胶质瘤细胞中的表达,并通过抑制靶基因CDC42和RhoA的表达而发挥抑瘤基因的功能。其中LRRC4-miR-185/SP1-DNMT1-LRRC4调控环路在胶质瘤的发生发展中发挥了重要的作用]miRNA也可作为抑瘤基因参与肿瘤的发生发展。MTT,细胞划痕,Transwell等实验证实miR-185可以抑制胶质瘤细胞的生长、运动和侵袭,而干扰miR-185能促进胶质瘤细胞的生长、运动和侵袭,因而miR-185可能在胶质瘤中可能发挥抑瘤基因的作用。为进一步阐明其作为抑瘤基因的功能,我们通过生物信息学预测并相关实验证实miR-185可抑制靶基因DNMT1的表达。DNMT1是维持甲基化必须且最主要的一种DNA甲基化转移酶,为此我们进一步运用HPLC-DAD检测发现过表达miR-185可抑制靶基因DNMT1下调全基因组甲基化水平。通过MassArray, qRT-PCR实验证实过表达miR-185下调LRRC4, GAD1, PCDHA8, PCDHA13, SST, NKDD1A, HIST1H3, PHOX2B, SIX3等9个高甲基化基因启动子甲基化水平并恢复这9个高甲基化基因在胶质瘤细胞中的表达。因此,iiR-185可通过抑制靶基因DNMT1调控全基因组甲基化水平,而恢复LRRC4等高甲基化基因的表达从而抑制胶质瘤细胞的生长与侵袭。根据GO分析结果,miR-185主要参与Rho GTP酶活性,而CDC42和RhoA是调控Rho GTP酶的主要分子。我们的实验证实CDC42和RhoA是miR-185的直接调控靶基因,CDC42或RhoA与miR-185在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达呈负相关。我们的研究表明,miR-185可通过直接抑制靶基因CDC42和RhoA的表达,间接下调VEGFA的表达从而抑制胶质瘤细胞的生长与侵袭。在胶质瘤中LRRC4的过表达可显著上调miR-185的表达,而miR-185可通过抑制DNA甲基化转移酶DNMT1调控全基因组甲基化水平,从而上调LRRC4等高甲基化基因的表达。因而在LRRC4, miR-185, DNMT1之间可形成LRRC4-miR-185-DNMT1-LRRC4调控环路参与胶质瘤的发生发展。另外我们证实SP1可正性调控DNA甲基化转移酶DNMT1的表达,DNMT1可上调LRRC4的表达,而LRRC4又可通过负性调控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信号通路抑制转录因子SP1的表达及转录活性。因此,在LRRC4, SP1, DNMT1之间可形成LRRC4-SP1-DNMT1-LRRC4调控环路参与胶质瘤的发生发展。总之,胶质瘤的发生发展是一个多基因参与、多阶段变异累积形成的病理过程。基因、miRNA.转录因子和DNA甲基化修饰等在胶质瘤的发生发展过程中扮演重要角色,它们或相互支撑,或相互拮抗,从而构成胶质瘤发生发展过程中的复杂的调控网路。综合我们以上的研究结果,我们在研究LRRC4通过miRNA发挥抑瘤功能的同时,发现受LRRC4调控的miRNA也可以通过其直接调控的靶基因(如LRRC4)介导的信号转导通路调控转录因子与DNA的结合,或通过直接靶向DNA甲基化转移酶而调控全甲基化基因组水平,从而调控诸如LRRC4等高甲基化基因的甲基化水平和表达变化,从而在胶质瘤中形成了以LRRC4为核心的多相调控环路,即LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4、LRRC4-miR-185-DNMT1-LRRC4及LRRC4-SP1-DNMT1-LRRC4。这些调控环路在胶质瘤中形成了多个正性反馈的调节过程,参与胶质瘤的发生发展。