在全球范围内,肺腺癌的发病率、死亡率均位于癌症之首,随着精准医疗时代的来临,肺腺癌的研究重点转向基于肿瘤分子特性的靶向治疗,因此阐明肺腺癌复杂的分子机制已成为肺腺癌研究的主流趋势,而关键基因和关键信号途径异常是肺腺癌分子机制的主要研究对象。且肺腺癌组织细胞多在早期即伴有NF-κB信号途径的激活[1,2],并与肺腺癌TNM分期和较差的预后密切相关[2,3]。尽管对于NF-κB信号途径激活的详细分子机制尚未完全了解,但通过各种途径抑制NF-κB可抑制肺腺癌细胞的生长增殖,已被大量实验证据证明[4,5]。因此干预NF-κB信号途径已成为肺腺癌靶向治疗的策略之一。lncRNA(long non-coding RNA)是一类转录本长度大于 200nt 的 RNA,主要由RNA聚合酶Ⅱ转录,多具有5’帽和多聚腺苷酸尾,无蛋白质编码功能或仅编码微肽。因具有相对较长的核苷酸链,1ncRNA可在分子内折叠形成许多特定复杂的二级空间结构,能提供多个与分子结合的位点,共同发挥生物学功能,同时也造成了lncRNA复杂多样的调节功能机制[6]。目前仅有少部分lncRNA的结构和功能得到了研究。近年来,关于lncRNA参与NF-κB信号途径调控的研究已陆续开展。2015年,Krawczyk等鉴定了一个新的lncRNA PACER。通过直接作用,PACER促进抑制型的p50/p50二聚体被激活型的p65/p50二聚体取代,结合结构基因COX2的启动子,从而激活该基因转录[7]。因此lncRNA不仅参与NF-κB信号途径的调控,其本身更应看作NF-κB信号网络的组成成分,目前这方面的研究刚刚开始,更多lncRNA和NF-κB信号途径的关联性有待发掘。同时,病理情况下,lncRNA本身的表达或功能异常可能引起NF-κB信号途径的功能异常,因此对NF-κB信号途径相关lncRNA的筛选鉴定,可能拓展对NF-κB异常激活的分子机制的认识,且为肺腺癌患者的个体化治疗提供更多可能的候选靶点。而在肺腺癌中,lncRNA LOC101929897对NF-1κB经典途径的作用还未有人研究。第一部分LOC101929897通过上调IKKβ活化经典NF-κB途径,促进肺腺癌发生发展的机制研究研究目的:明确lncRNA LOC101929897是否通过上调并激活IKKβ,进而激活经典的NF-κB信号途径,从而促进肺腺癌的发生发展。1、芯片检测利用芯片检测三对肺腺癌和癌旁正常组织标本中lncRNA和mRNA表达谱的改变,分析芯片结果,筛选其中差异表达的lncRNAs,芯片结果显示:相比癌旁正常组织,在肺腺癌组织中有585个lncRNA表达上调,有2294个lncRNA表达下调,且有835个mRNA表达上调,有845个mRNA表达下下调,其中,lncRNA LOC101929897 和 IKKβ 表达同步上调。2、标本验证提取上述三对肺腺癌和癌旁正常组织标本的总RNA和总蛋白,应用qRT-PCR、Western blotting 验证 LOC101929897、IKKβ mRNA 的表达水平是否与芯片结果一致,结果显示:肺腺癌组织相较于癌旁正常组织,均呈现LOC101929897和IKKβ的表达同步上调。3、LOC101929897、IKKβ在肺腺癌细胞中的基础表达以及NF-κB基础活性检测。1)用qRT-PCR、Northern blotting检测比较多个肺腺癌细胞株与肺正常上皮细胞株的 LOC1 01929897、IKKβ mRNA 表达水平,Western blotting 检测比较 IKKβ的表达水平,结果显示:肺腺癌细胞株相对于肺正常上皮细胞株均呈现IKKβ和LOC101929897的同步上调,且上调程度与肺腺癌细胞的恶性程度呈正相关。2)应用报告基因分析和凝胶滞留法(EMSA)检测比较多个肺腺癌细胞株和肺正常上皮细胞株的NF-κB基础活性,结果显示:NF-κB的活性增强与LOC101929897、IKKβ上调趋势一致,且与肺腺癌细胞的恶性程度呈正相关。4、LOC101929897通过上调IKKβ激活经典的NF-κB信号途径根据3的结果,构建LOC101929897及其反义链表达载体,设计合成LOC101929897S的siRNA。选取LOC101929897相对低表达的A549细胞和相对高表达的HCC827细胞,在前者过表达LOC101929897,在后者干扰LOC101929897表达,进行功能获得和功能缺失分析,qRT-PCR检测LOC101929897 和 IKKβ mRNA 的表达改变;Western blotting 检测总 IKKβ、P-IKKβ、总IκBα、P-IκBα的含量变化;EMSA检测NF-κB的核内迁移,结果显示:与表达LOC101929897反义链的阴性参照相比,过表达LOC101929897的A549细胞,其总IKKβ、pIKKβ升高,总IκBα降低,pIκBα升高,NF-κB核内迁移增多;反之,在HCC827细胞敲低LOC101929897的表达,上述结果与过表达 LOC101929897 相反。5、LOC101929897促进肺腺癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用研究在LOC101929897过表达和干扰的肺腺癌细胞中,采用MTT、平板克隆形成实验、流式细胞技术、Transwell和划痕实验等检测LOC101929897对肺腺癌细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移能力的影响,结果显示:与表达LOC101929897反义链的阴性参照相比,过表达LOC101929897的A549细胞,增殖、迁移能力增强,细胞周期无明显变化;反之,在HCC827细胞敲低LOC101929897的表达,细胞增殖、迁移能力减弱,细胞周期无明显变化。结论:LOC101929897通过上调IKKβ活化经典NF-κB途径,从而促进肺腺癌发生发展。第二部分初步确定LOC101929897在肺腺癌中上调IKKβ的分子机制研究目的:初步确定LOC101929897是否作为ceRNA,通过与IKKβ mRNA竞争结合miR-4741,增强IKKβ mRNA的稳定性,从而上调IKKβ。研究方法和结果:1、确定LOC101929897对IKKβ的上调作用发生在转录后水平1)亚细胞定位:分别提取肺腺癌细胞A549、H1299和HCC827的细胞核和细胞浆RNA,利用qRT-PCR进行绝对定量,测定LOC101929897在核浆分布比例;利用RNA荧光原位杂交,制备A549、H1299和HCC827细胞涂片,用激光共聚焦显微镜检测LOC101929897的亚细胞定位,结果显示:LOC101929897大部分位于细胞浆中,少部分位于细胞核中。2)生物信息学分析:应用 RegRNA2.0、TargetScan7.1 分析 LOC101929897序列,发现无ORF,包含miR-512-5p和miR-4741应答元件,同时miR-4741也靶向IKKβmRNA。3)用 Act-D 处理 A549、H1299、HCC827 细胞,提取总 RNA,qRT-PCR测定IKKβmRNA的半衰期,结果显示:在三种细胞中,A549的IKKβmRNA半衰期时间为 3.4h,H1299 为 8.2h,HCC827 为 13.7h。4)在A549中过表达LOC101929897 24h后,用Act-D处理细胞,提取总RNA,测定IKKβ mRNA的半衰期,结果显示:对照组A549中IKKβ mRNA的半衰期时间为3.3h,过表达LOC101929897后,IKKβmRNA的半衰期为8.7h。5)构建pGL4.10[luc2]-pIKBKB重组质粒,在A549和HCC827中分别以pcDNA3.1(+),非特异性干扰RNA(nc)分别作为阴性参照,在A549中过表达LOC101929897 24h,HCC827 中干扰 LOC101929897 表达 24h 后,再瞬时转染pGL4.10[luc2]-pIKBKB,pRL-TK作为内参,测定双荧光素酶活性,结果显示:和阴性对照相比,过表达或者干扰LOC101929897后,两种细胞中pGL4.10[luc2]-pIKBKB的活性无明显变化。2、初步判断 LOC101929897 是一个 ceRNA1)提取 A549、H1299、HCC827 细胞的总 RNA,用 qRT-PCR 检测 miR-4741和miR-512-5p的相对含量,结果显示:在三种细胞中miR-4741无明显变化;miR-512-5p在A549中含量最高,在HCC827中最低。2)用Act-D处理A549、H1299、HCC827细胞,提取总RNA,测定LOC101929897的半衰期,结果显示:A549的LOC101929897半衰期为6.6h,H1299 为 9.3h,HCC827 为 13.7h。3、LOC101929897作为ceRNA的分子机制研究用 miR-512-5p inhibitor 瞬时转染 HCC827,用 miR-512-5p mimics 瞬时转染H1299,提取总 RNA 和总蛋白,用 qRT-PCR 检测 IKKβ 和 LOC101929897,Western检测IKKβ蛋白水平,结果显示:在HCC827中,IKKβ和LOC101929897含量降低;在H1299中,结果与之相反。结论:1、LOC101929897主要位于胞浆,对IKKβ的上调作用发生在转录后水平。2、LOC101929897可能作为内源性ceRNA,通过与IKKβmRNA竞争结合miR4741,增强IKKβmRNA的稳定性,从而上调IKKβ。