研究背景恶性黑色素瘤(malignant melanoma)是一种最具侵袭性的皮肤肿瘤,具有发病年龄早,转移率高的特点,并对目前临床各种治疗方法极不敏感。化疗是黑素瘤重要的治疗方法,但其对化疗药物敏感性低且易产生耐药。肿瘤细胞对凋亡的抵抗性可降低细胞对化疗药物的敏感性,凋亡及其调节因子是决定黑素瘤耐药的重要机制。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, IAP)家族的新成员,是目前发现最强的凋亡抑制因子。它在细胞有丝分裂和凋亡过程中起重要的调节作用,是一个双功能蛋白质,既影响有丝分裂器装配,维持细胞倍性和胞质分裂时间,又通过其磷酸化作用在细胞分裂中调节凋亡。反义核酸技术能够选择性抑制靶基因表达,起到负调控靶基因的作用,因此被用于研究基因的生物学功能以及研究和开发能封闭有害基因表达的反义核酸药物。反义核酸技术作为一种选择性封闭目的基因表达的基因治疗方法,丰富和发展了恶性黑色素瘤研究和治疗手段。紫杉醇是从紫杉(红豆杉)的树皮中提取的一种化合物,目前是临床上治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的一线用药,但用于恶性黑色素瘤治疗的报道国内很少。研究紫杉醇对恶性黑色素瘤的作用,并将其与应用survivin的基因治疗相结合,必然会对恶性黑色素瘤的研究提供新的尝试。目的在本研究中,我们首先观察紫杉醇对恶性黑色素瘤细胞的促凋亡作用,然后检测survivin反义寡核苷酸转染后对恶性黑色素瘤细胞增殖和凋亡的影响,并进一步检测二者联合对恶性黑色素瘤细胞的作用,从而对恶性黑色素瘤的生物化学联合治疗方案提供新的探索和尝试。方法1、取对数生长期人黑色素瘤A375,分别应用不同浓度紫杉醇(10、50、100、1000nmol／L)作用细胞24、48、72h后,采用噻唑蓝比色法测定细胞增殖抑制率,双变量流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测存活素蛋白的表达,检测其抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用。2、取对数生长期人黑色素瘤A375,分为对照组(不行转染)、正义链组(转染存活素正义寡脱氧核苷酸)、错义链组(转染存活素错义寡脱氧核苷酸)、脂质体组(仅用脂质体处理)、反义链组(转染survivin ASODN,并根据转染物浓度再分为200、400、600 nmol／L 3个组),利用脂质体进行转染。倒置荧光显微镜下观察转染效果。采用噻唑蓝比色法测定细胞增殖抑制率,双变量流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测存活素蛋白的表达,激酶法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的活性。3、联合应用Survivin反义寡核苷酸和紫杉醇作用于细胞,采用噻唑蓝比色法测定细胞增殖抑制率,双变量流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测存活素蛋白的表达,检测二者的联合作用。结果1、紫杉醇作用于A375细胞(1)、不同浓度的紫杉醇分别作用24h、48h和72h对A375细胞生长抑制结果表明：①随着药物浓度的增加,细胞存活率降低,有显著的剂量依赖关系,但当浓度增加至1000n m o l／L时,细胞生长抑制率增加不显著。②同一浓度的药物有时间依赖关系,随着作用时间的延长,细胞存活率降低,以作用48h时最显著。(2)、F C M结果显示10n m o l／L紫杉醇作用24h后G2／M期细胞即增多,同时细胞凋亡率与对照组相比从5.23%增至1 5.23%,表明紫杉醇具有显著的周期阻滞及诱导细胞凋亡的作用。低浓度范围内(10～100 nmol／L),细胞凋亡率随药物浓度的增加而显著增加(P<0.05),呈浓度依赖性,而浓度进一步增加,凋亡率增加不显著(P>0.05)。相同浓度的紫杉醇随作用时间的延长,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),呈时间依赖关系。(3)、不同浓度紫杉醇作用24h后,survivin的表达是逐渐增加的,有浓度依赖关系。而随着作用时间的延长,至48h后survivin的表达与对照组相比是减弱的,survivin的表达呈现出随时间先升高后降低的变化趋势。2、survivin ASODN转染A375细胞(1)、反义链600 nmol／L组细胞转染率大于80%。(2)、与脂质体组[(4.7±0.4)%]、正义链组[(5.2±0.3)%]比较,反义链200、400、600 nmol／L组细胞增殖抑制率[(10.3±0.6)%、(16.7±0.6)%、(24.7±0.7)%]显著增加(F=3662.0,P<0.05)。(3)、反义链200、400、600 nmol／L组24 h细胞凋亡率分别为(13.5±1.9)%、(20.1±1.5)%、(32.1±2.9)%,显著高于对照组、正义链组、错义链组、脂质体组的(6.5±0.6)%、(5.6±0.7)%、(6.4±1.0)%、(6.5±1.3)%(F=139.9,P<0.05),细胞被阻滞在G2／M期。(4)、与对照组比较,反义链各浓度组存活素蛋白表达量减少,caspase-3活性显著增高(F=63.1,P<0.05)；正义链组、错义链组、脂质体组caspase-3活性与对照组比较差异无统计学意义(F=0.512,P>0.05)。3、survivin ASODN和紫杉醇共同作用A375细胞(1)、细胞增殖抑制率ASODN+ taxol组各组24h细胞增殖抑制率分别为ASODN 200 nmol/L+taxol 50 nmol/L组34.29±0.85%、ASODN 400 nmol/L+taxol 50 nmol/L组36.22±0.26%、ASODN 600 nmol/L+taxol 50 nmol/L组40.42±0.58%、ASODN 200 nmol/L+taxol 100 nmol/L组40.15±1.39%、ASODN 400 nmol/L+taxol 100 nmol/L组44.65±0.37%、ASODN 600 nmol/L+taxol 100 nmol/L组48.55±0.88%,与相应浓度ASODN转染组、taxol组相比,细胞增殖抑制率显著提高。48h比24h抑制率抑制率进一步提高。(2)、细胞凋亡率ASODN+taxol组凋亡率显著高于对照组组(F=88.7,P<0.05),且随转染浓度增加而增加。同一浓度紫杉醇组,随ASODN浓度的增高,凋亡率增高,有显著剂量依赖关系。相同浓度组细胞48h凋亡率比24h显著增高,有时间依赖关系。(3)、Survivin蛋白的表达ASODN+ taxol组细胞survivin蛋白的表达量较对照组减少,随着转染物浓度的提高,表达量逐渐降低。结论1、紫杉醇对人恶性黑色素瘤A375细胞有较强的生长抑制及诱导凋亡作用,有显著的细胞周期阻滞作用。紫杉醇对A375的作用有时间-剂量依赖性。2、低剂量长时间作用和高剂量短时间的作用模式对于黑素瘤细胞凋亡率的影响相差不大,而后者的细胞毒性要高于前者,应用低剂量延长作用时间可作为临床给药的一种参考。3、抑制survivin的表达是紫杉醇诱导细胞凋亡的途径之一,survivn的表达也与细胞对紫杉醇产生抗药性有关。4、Survivin ASODN转染A375细胞,能够呈浓度-时间依赖性抑制细胞增殖,促进其凋亡,有显著的细胞周期阻滞作用。5、Survivin ASODN转染能够在翻译水平抑制目的基因的表达,降低目的蛋白的含量,促进肿瘤细胞的凋亡。ASODN作用于目的基因具有高特异性。6、抑制caspase-3的活性是survivin抑制A375细胞凋亡的重要途径之一。7、Survivin ASODN和紫杉醇联合应用可与单一用药相比可显著抑制A375细胞增殖,促进细胞凋亡。8、Survivin ASODN转染细胞可显著降低A375细胞对紫杉醇的耐药性,提高敏感性。9、Survivin蛋白的表达是A375细胞对紫杉醇产生耐药性的机制之一。意义紫杉醇是目前临床上治疗多种肿瘤的一线用药,但用于恶性黑色素瘤治疗的报道国内很少。我们的实验不仅证实了紫杉醇对A375细胞有较强的生长抑制及诱导凋亡作用,而且对其抗肿瘤的机制做了深入研究,这些不同的作用机制将为如何提高紫杉醇对恶性黑色素瘤的疗效提供联合用药的新思路。Survivin基因是目前发现最强的凋亡抑制因子,是肿瘤靶基因治疗的热点。本实验应用反义寡核苷酸技术转染黑素瘤细胞,进一步探讨了Survivin基因的功能及作为靶点在恶性黑色素瘤基因治疗中的意义。目前,联合基因治疗和传统化疗成为肿瘤治疗中新的研究方向,我们将较为先进的反义寡核苷酸技术和经典的化疗药物相结合,率先应用于恶性黑色素瘤细胞,检测二者的联合作用效果,发现了恶性黑色素瘤细胞对紫杉醇耐药的新机制,并且首先在体外将survivin反义寡核苷酸和紫杉醇相结合从而更为有效的诱导细胞凋亡,为恶性黑色素瘤新的治疗模式做了有益的探索。