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背景与目的:戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的急性传染性疾病,在发展中国家持续构成严重威胁,每年至少有2000万HEV感染病例,有症状的病例超过300万例,死亡人数约6万人。孕妇在妊娠晚期感染可导致高达30%的死亡率,免疫功能低下的患者感染后会慢性化。到目前为止,仍没有有效的、非致畸的针对HEV感染的特殊治疗方法,因此如何有效预防和控制HEV的传播成为一个重要的公共卫生问题。目前,两种基于人HEV序列的重组疫苗已在我国进行了临床试验,其中首个商用HE疫苗（Hecolin）已于2012年在中国获得许可;另一种HE病毒样颗粒（Virus like particles,VLPs）疫苗p179由本实验室和长春生物制品研究所共同研制。虽然现有的HE疫苗对健康成人具有很好的保护作用,但注射类疫苗由于不良反应较多而不利于推广。相比之下,重组HE口服疫苗的研制成本较低、免疫方式简单且安全性更高,并能够刺激肠粘膜产生有中和病毒能力的分泌型Ig A（s Ig A）,在一定程度上可弥补注射疫苗的不足。本课题拟设计并筛选出1种不被消化酶降解的HEV重组衣壳蛋白作为口服疫苗抗原,并首次将壳聚糖纳米材料（Chitosan nanoparticles,CSNPs）用作重组HE口服疫苗的抗原递送系统,旨在研发出一种安全、高效益/成本比、且能够刺激机体产生高水平免疫反应的新型重组HE口服疫苗制剂。研究方法:1.表达并筛选重组HE口服疫苗抗原:采用利用大肠杆菌系统表达HEV重组衣壳蛋白p146（aa 460-605）,其余2种候选蛋白p179（aa 439-617）和p222（aa 439-660）前期已表达成功并保存于本实验室。比较3种候选蛋白的理化性质、体内外对消化酶的抵抗能力、对酸碱环境的耐受性、抗原性、免疫原性和稳定性,最终筛选出1种蛋白作为口服疫苗抗原。2.探究HEV重组衣壳蛋白抵抗消化酶降解的机制:预测重组蛋白的3D结构;运用蛋白质分子对接、溶剂可及性分析等手段,结合体内外消化酶降解实验,预测3种重组蛋白的胃蛋白酶和胰蛋白酶降解位点;比较突变型单体p179与野生型二聚体p179的胃蛋白酶、胰蛋白酶降解实验结果,探究HEV重组衣壳蛋白的二聚化结构在抵抗消化酶降解中的作用。3.制备、优化及表征壳聚糖纳米材料:采用离子交联法制备CSNPs,用CSNPs封装抗原制备成重组HE口服疫苗。运用动态光散射（DLS）,透射电子显微镜（TEM）和场发射扫描电子显微镜（FESEM）技术表征纳米材料;采用Bradford法检测CSNPs的包封效率、载药量和体外抗原释放率;MTT实验检测纳米材料的细胞毒性。4.重组HE口服疫苗的免疫学研究:以口服灌胃的方式免疫Balb/C小鼠,间接ELISA法比较小鼠的体液免疫应答水平,确定小鼠的最佳免疫次数和免疫剂量;细胞免疫应答水平和类型采用ELISA、流式细胞术和q RT-PCR进行检测。最后综合分析免疫学实验结果,确定CSNPs在增强小鼠免疫应答中发挥的作用,进而评价CSNPs作为HE口服疫苗抗原递送系统的潜力。研究结果:1.重组蛋白表达及口服抗原的筛选1.1 p146在大肠杆菌中以可溶性蛋白的形式表达,预期片段长度为16.86k Da,实际片段长度符合预期;p179和p222的分子量分别为20k Da和25k Da。1.2消化酶降解实验:经证实p146为抵抗消化酶降解的最小单位（体内外消化酶降解前后分子量不变）;p179被胃蛋白酶降解后剩余约18k Da,p222被胃蛋白酶降解后剩余两种长度的片段（18k Da和20k Da左右）;p179和p222被胰蛋白酶降解后均剩余17-18k Da;在小鼠体内,p179和p222均被降解为16k Da左右的片段。1.3 TEM检测结果显示p146自发形成VLPs较多且形态典型;酸碱耐受实验表明3种重组蛋白均能够完全抵抗消化道的酸碱环境且高级结构不被破坏;以纯化的重组蛋白直接口服免疫小鼠,p146和p222组小鼠血清抗HEV Ig G阳性率可达到100%,但低浓度的p146即可刺激小鼠产生抗体;稳定性检测实验结果表明p146的热稳定性优于p222。1.4综上各项结果本课题最终确定p146作为重组HE口服疫苗的抗原。2.探究HEV重组衣壳蛋白抵抗消化酶降解的机制2.1 p179的胃蛋白酶降解位点有3组（Y443与L607、Y443与Y616、L607）;p222的胃蛋白酶降解位点有3组（Y443与L607、Y443与D625、L607）;p179的胰蛋白酶降解位点为R451、R460和R466;p222的胰蛋白酶降解位点有3组（R451与R619,R460与R619、R460与R631）。胰蛋白酶和胃蛋白酶对重组蛋白的裂解均发生在P2结构域（aa 456-606）之外,且仅发生在重组蛋白N端和C端的P1-P2连接区及C-末端延伸范围内。2.2在大肠杆菌中表达的突变型p179被证实为单体蛋白（实际分子量20k Da）,单体p179被胰蛋白酶完全降解,被胃蛋白酶降解为16-17k Da的片段;2.3生物信息学研究表明,胰蛋白酶降解位点（R542、K544和K554）和胃蛋白酶降解位点（N562、N587）隐藏在二聚化结构内部,因此这些位点在单体中更加暴露于溶剂,故单体蛋白更易被胰蛋白酶和胃蛋白酶降解。2.4 HEV重组衣壳蛋白的二聚化结构和相对保守的抗原组成是保证其不被消化酶降解的重要原因。3.壳聚糖纳米材料制备条件的优化与材料的表征3.1采用离子交联法制备CSNPs和CSNPs/p146,形成稳定的纳米体系所需的最佳浓度配比为CS（2mg/ml）和TPP（1mg/ml）;3.2在制备CSNPs/p146的过程中,能够使CSNPs达到最佳的包封率、载药量和最长抗原释放时间的p146投入量为1mg/ml;3.3纳米材料采用DLS、TEM和FESEM表征,结果显示制备的CSNPs和CSNPs/p146均为纳米级颗粒（由于测试条件不同,DLS、TEM和FESEM测出的材料平均直径略有差异）,CSNPs/p146比CSNPs粒径有所增大,两种纳米形貌均为类圆形,材料在溶液中有较好的均一性及稳定性;3.4体外MTT实验证实CSNPs/p146对L929细胞无毒,因此制备的纳米材料有良好的生物相容性,能够应用于口服疫苗的递送系统。4.确定小鼠口服免疫程序并检测口服免疫效果4.1小鼠最佳的口服免疫程序为4次免疫（0d、14d、28d、56d）,其中每只小鼠采用200μl的CSNPs/p146进行免疫,且每次免疫CSNPs/p146中封装的p146剂量200μg;4.2相比纯化p146直接口服免疫小鼠,CSNPs/p146能够提高小鼠的体液、粘膜和细胞免疫应答水平,CSNPs递送抗原能够引出小鼠Th2偏向型细胞免疫应答;4.3 CSNPs作为抗原递送系统降低重组蛋白p146的使用量;4.4以CSNPs/p146口服免疫小鼠,刺激小鼠产生细胞免疫应答水平高于单独CSNPs免疫和单独p146免疫,因此CSNPs具有疫苗佐剂的潜力。研究结论:本研究设计并表达一种不被消化酶降解的HEV重组衣壳蛋白p146,并首次采用CSNPs粘膜给药系统负载p146,制备成重组HE口服疫苗—CSNPs/p146。材料表征结果显示CSNPs/p146粒子为纳米级,体系稳定且安全。口服CSNPs/p146能够增强小鼠的体液、粘膜和细胞免疫应答水平,细胞免疫应答类型为Th2型。本研究结果表明,CSNPs在重组HE口服疫苗中发挥了佐剂和递送系统的双重作用、能够降低p146的使用量并刺激小鼠产生高水平免疫应答反应。CSNPs/p146因其高效性、安全性和低成本性而有望成为重组HE口服疫苗的有力候选者,具有良好的研究前景。