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嗜热酯酶是最具有应用潜力的绿色生物催化剂之一,因其具有耐热性、pH稳定性和有机溶剂耐受性等特点广泛应用于各个行业。前期从超嗜热菌Aquiex aeolicus VF5（风产液菌）基因组中筛选得到一种嗜热酯酶基因Aaeo1,实现了其在大肠杆菌系统（Escherichia coli）中的异源表达,发现其存在包涵体及催化活力低的问题。为了得到高效的嗜热酯酶,利用定向进化对其进行分子改造,通过两步高通量筛选法得到可溶性表达和催化活力同时提高的突变株并进行酶学性质研究。具体包括:（1）建立了易错PCR（error-prone PCR,epPCR）突变反应体系。确定最优条件:Mg2+7 mmol·L-1,Mn2+0.2 mmol·L-1,平均突变率为0.31%,满足构建文库要求;（2）建立了灵敏、快速、高效的两步高通量筛选法。以split-GFP为报告基因结合定向进化手段构建突变文库,与以全长增强型GFP（EGFP）为报告基因相比,有效地降低了筛选过程中的荧光背景和假阳性程度,阳性突变率从88%提高至95%。根据荧光强度与酶活力/蛋白浓度之间良好的线性关系,通过流式细胞分选仪从库容量不小于104的突变文库中初筛得到可溶性表达提高的突变株,对初筛目的菌株进行酶活力复筛;（3）筛选获得了可溶性表达和酶活力同时提高的突变株。通过两步高通量筛选得到了2株优势突变菌株EP1和EP2,分别含有4个氨基酸突变位点:I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,纯化后的突变酶EP1和EP2的比活力分别是野生型的3.14、3.2倍左右。通过定点突变筛选得到突变株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分别是野生型的2.35、2.46、4.5倍。对两个位点分别构建小型饱和突变文库,筛选后进行组合得到突变株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。纯化后突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分别是野生型的6.86、10.01、14.86倍;（4）研究突变酶的一系列酶学性质。突变酶均在70 oC时测定最大酶活性,突变后仍保持嗜热性,且在高温条件下更稳定。突变酶的最适pH值均为8.0,且在微碱性环境下催化效果更佳。突变酶EP1和EP2的Km值降低,说明突变酶对底物的亲和力增强,kcat/Km值分别是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增强。突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的Km值提高,kcat/Km值分别是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物结合口袋的变化导致突变酶的催化能力的提高;（5）通过同源建模分析了Aaeo1突变体酶活提高的机制。蛋白质分子空间结构模拟显示,推测E170D突变改变了Aaeo1的口袋。第170位点与活性位点Asp163的距离约为8.9?,第51位点与Ser62之间仅由一个β-sheet连接,可能会通过长距离或短距离影响酶活力的变化。