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microRNAs(miRNAs)是一类进化上高度保守的内源性非编码小分子RNA,它能够结合于靶基因mRNA的3、-UTR区域,阻遏靶基因的翻译,从而抑制基因表达。miRNAs在许多病理、生理过程中,包括癌症发生及癌细胞转移中扮演重要的角色。miRNAs作为一类新型的调节因子,既可以作为原癌基因发挥作用,也可以作为抑癌基因调节细胞的生物学特性。miR-21作为一个典型的原癌基因,在肿瘤的的发生发展过程中同样扮演令人瞩目的角色,如肝癌中miR-21的异常表达能够促进肝细胞癌的生长与转移。作为miR-21代表性的靶基因,癌细胞中PTEN的失活导致了下游PI3K/AKT和ERK信号通路的激活,从而增强了癌细胞的增殖与转移能力;然而,在PTEN沉默的癌细胞中,miR-21表达的变化同样引起了AKT/ERK信号通路活性的变化,这表明细胞中除了PTEN还存在其它机制调节AKT/ERK信号通路。hSulf-1是一种细胞膜上的肝素去硫酸酯酶,它能够对细胞膜上的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)去硫酸化,从而阻断肝素结合生长因子信号的传导。通过调节肝癌细胞系中miR-21的表达,发现miR-21抑制PTEN表达的同时也能够抑制hSulf-1的表达。因此,本研究旨在探索miR-21对hSulf-1及下游信号通路的影响,进一步研究miR-21对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的影响,为肝癌的临床基因治疗提供新的靶点。第一部分肝癌细胞系miR-21的表达及其与成瘤能力的关系【目的】检测不同细胞系中miR-21的表达,确定miR-21与肝癌细胞转移能力的相关性。【方法】应用荧光实时定量PCR检测miR-21在不同转移性肝癌细胞系及正常细胞系中的表达水平;建立肝癌细胞小鼠体内移植瘤模型,两周后处死,并测量肿瘤形成情况,比较不同转移性肝癌细胞的瘤形成能力,确定miR-21表达水平与肝癌细胞转移性能之间的相关性。【结果】荧光实时定量PCR表明,miR-21在肝癌细胞系MHCC-97H(MHCC-97H:6.73±1.01)中表达高于MHCC-97L、 SMMC-7721(MHCC-97L:4.35±0.53,SMMC-7721:1.10±0.13)中表达;动物成瘤实验表明高转移性肝癌细胞MHCC-97H比SMMC-7721细胞形成更多更大的瘤块。【结论】miR-21在高转移性的癌细胞中高表达,miR-21的高表达与癌细胞的转移呈正相关。第二部分miR-21对肝癌细胞侵袭、迁移、增殖及成瘤能力的影响【目的】研究miR-21对肝癌细胞侵袭、迁移、增殖及成瘤能力的影响。【方法】采用划痕实验、Transwell实验检测miR-21对肝癌细胞侵袭、迁移的影响;应用MTT实验、细胞软琼脂克隆形成实验研究miR-21对肝癌细胞增殖、成瘤能力的影响。【结果】划痕实验、Transwell实验结果表明,与实验对照组相比,miR-21过表达载体转染SMMC-7721细胞促进了细胞的侵袭及迁移能力,miR-21抑制剂转染MHCC-97H细胞抑制了细胞的侵袭与转移能力;细胞增殖实验结果表明,SMMC-7721转染miR-21过表达载体后促进了细胞的增殖,MHCC-97H转染miR-21拮抗剂后减弱了细胞的增殖能力;细胞软琼脂克隆形成实验表明,miR-21过表达载体转染SMMC-7721细胞增强了细胞的成瘤能力,MHCC-97H中转染miR-21拮抗剂减弱了MHCC-97H细胞的肿瘤形成能力。【结论】miR-21能够调节肝癌细胞的侵袭、转移、增殖及成瘤能力。第三部分miR-21调节肝癌细胞侵袭、迁移、增殖的分子机制【目的】研究miR-21调节肝癌细胞侵袭、迁移、增殖可能的分子机制。【方法】miR-21过表达载体转染SMMC-7721细胞,miR-21抑制剂转染MHCC-97H细胞,荧光实时定量PCR检测处理后SMMC-7721和MHCC-97H中miR-21的表达;蛋白免疫印迹法检测SMMC-7721和MHCC-97H中EMT标志物及PTEN、hSulf-1信号通路的变化。【结果】荧光实时定量PCR实验显示,SMMC-7721转染miR-21过表达载体后miR-21表达上调,MHCC-97H转染miR-21抑制剂后miR-21表达下调;蛋白免疫印迹实验结果显示,miR-21过表达导致上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物β-catenin、vimentin上调,与此同时,伴随着PTEN、hSulf-1的下调,p-AKT、p-ERK的表达呈现上调趋势。相反的,MHCC-97H细胞中miR-21低表达导致E-cadherin上调、β-catenin、vimentin下调,同样伴随着PTEN、hSulf-1的上调,p-AKT、p-ERK表达的下调。【结论】miR-21能够通过PTEN、hSulf-1信号通路调节EMT过程,从而调节癌细胞的增殖、侵袭与转移。