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茉莉酸信号在植物发育和防卫反应中起着重要作用。我们从两个独立的水稻Tos17插入突变群体NC2728和ND5001中发现了相同表型的小花突变体。我们将这两个突变体分别命名为openglume1-1(ogm1-1)和openglume1-2(ogm1-2),并将这种小花开放缺陷表型命名为openglume。初步检测表明,ogm1-1和ogm1-2突变体均属甲基茉莉酸(Methyl jasmonate,MeJA)响应缺陷突变体。
本文对NC2728和ND5001突变群体及其后代进行了遗传学分析,结果表明ogm1-1和ogm1-2突变体均属隐性遗传突变体。比较两个突变群体中Tos17插入侧翼序列标签后发现,两个突变群体中均有一个标签定位到水稻TIGR数据库注释的LOC Os05g50890基因内,暗示openglume突变表型可能是由于此基因的Tos17插入突变造成的。进一步对这两个突变群体的Southern杂交分析结果显示,仅仅LOC_Os05g50890基因内的Tos17插入纯合体才具有openglume突变表型,从而证实openglume突变表型与插入LOC_Os05g50890基因的Tos17紧密连锁。我们将LOC Os05g50890基因命名为OPENGLUME1(OGM1)。OGM1基因编码一个植物GH3家族蛋白。进化树分析结果显示,OGM1蛋白与拟南芥AtJAR1蛋白,烟草NcJAR4蛋白同源性最高(59.7%和65.0%)。Northern杂交结果显示,Tos17在OGM1基因的插入引发了OGM1基因的非正常转录,产生了异常转录本。
我们从野生型水稻中克隆了OGM1基因,并用于转化ogm1-1突变体,对转基因水稻的分析结果表明,OGM1基因的表达使突变体恢复了野生型表型,表现出正常的小花开放表型和对外源MeJA的敏感性。与野生型水稻相比,openglume突变体对稻瘟病病菌侵染的敏感性明显增高,而在野生型背景下过量表达OGM1的转基因株系对稻瘟病病菌的抗性明显增强,暗示OGM1基因可能是一个稻瘟病抗性的正调控因子。
OGM1启动子驱动的GUS转基因水稻分析结果表明,OGM1基因在根、茎、叶和花中都有表达,这和野生型水稻的Northern杂交结果一致。更详细的GUS活性检测表明,在根、茎、叶和叶鞘中,OGM1基因在韧皮部中表达最强;在小花中,OGM1基因的表达随小花的发育而呈现动态的变化,这可能与小花发育、小花开放和花药开裂有关。另外,外源MeJA、机械损伤和稻瘟病病菌侵染能够诱导水稻OGM1基因表达的变化。
高效液相色谱一质谱/质谱法定量分析揭示,openglume突变体叶片中JA-Ile等JA-AA轭合物(Jasmonic acid(JA)-amino acid conjugates)含量比野生型显著降低(从62-92%不等)。我们构建了GST-OGM1融合基因细菌表达载体,表达并获得了GST-OGM1融合蛋白;随后以茉莉酸和氨基酸为底物,进行GST-OGM1融合蛋白体外酶促反应。对反应产物的检测结果表明,OGM1蛋白具有茉莉酸氨基酸合酶(JA-amido synthetase)活性,能够催化六种氨基酸(Ile、Val、Leu、Met、Trp与Phe)和茉莉酸结合形成相应的JA-AA轭合物。
综上所述,本文确证了ogm1-1和ogm1-2突变体的突变表型系由OGM1基因的插入突变所致,OGM1基因编码一个茉莉酸氨基酸合酶,其是茉莉酸信号转导途径中的一个关键成员,并在小花发育和植物防卫反应中起重要作用。