一、研究背景 肝脏干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。近年来，随着对肝脏干细胞在肝脏损伤和修复中作用的研究进一步深入，以OVC为代表的肝脏干细胞越来越成为人们关注的焦点。在胚胎发育过程中肝脏干细胞以肝细胞的形式存在，在成年哺乳动物的肝组织中以OVC存在，其特点是细胞小，呈卵圆型，核大而胞浆少。本课题组研究发OVC与原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)关系密切。在此基础上，我们采用光学显微镜、电子显微镜和免疫组化方法观察OVC在肝癌发生过程中的迁移和超微结构变化；以3’-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3’-methyl dimethylamino azobenzene,DAB)为诱导剂，建立大鼠肝脏OVC增殖模型，密度梯度离心法分离OVC，应用表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)对培养的OVC进行干预，观察OVC的细胞生物学变化；初步从组织、细胞、蛋白三个水平研究OVC在肝癌发生过程的作用和体外调控方法。 二、目的 本实验旨在探讨OVC在大鼠原发性肝细胞癌发生过程中的迁移及其超微结构的变化规律、摸索OVC的分离培养方法以及EGF对体外培养的OVC生长调控的机理。 三、方法和结果 1．采用DAB饲喂大鼠，诱导建立肝癌动物模型，结果显示DAB是一种简单经济有效的肝癌诱导剂。 2．全程病检监控肝组织的病理变化，发现HCC发生发展的过程可分为早、中、晚期三个阶段，分别是炎性变期、增生硬化期、癌变期；采用光镜、电子显微镜以及免疫组化的方法，分别在肝癌发生的早、中、晚期观察OVC在大鼠肝癌发生过程中的迁移变化和细胞超微结构的改变。结果显示：在诱癌早期，OVC首先出现于汇管区；在诱癌中期，OVC穿过界板浸润至肝小叶内；诱癌晚期，OVC散在分布于癌结节内，在癌灶周围有OVC堆积。电子显微镜观察显示在诱癌过程中，OVC逐渐出现细胞核增大且不规则、染色质边聚、细胞与周围组织间隙增宽等改变。免疫组化结果显示在诱癌的早期，CK18阳性的卵圆细胞首先出现于汇管区，呈点状分布;CK19阳性的卵圆细胞在汇管区片状分布;在诱癌中期，汇管区CK18阳性着色的卵圆细胞增多;在诱癌晚期，癌结节开始形成，CK18阳性细胞表达进一步增多，集中在汇管区，癌结节内也可见散在的阳性细胞;CK19阳性细胞仍呈大量表达，散在分布于癌结节内。 3.采用IV型胶原酶分次静脉灌注和改良密度梯度离心法分离肝脏卵圆细胞，结果显示该方法能成功获得高密度的细胞，所分离的细胞细胞形态学特点，以及同时表达CK18、CK19两种标记物，符合卵圆细胞特点。 4.观察体外培养的OVC在EGF的调控下的细胞生物学特点，同时采用westem blot法检测OVC p21ras蛋白的表达。结果显示:OVC pZ lras蛋白表达与细胞活性呈正相关(r=0.891p<0.01)。四、结论 1.OVC的增殖迁移贯穿大鼠肝癌发生过程。在此过程中OVC逐渐具有部分癌细胞的超微结构特点，提示OVC在诱癌剂的持续作用下参与HCC的形成。 2.Iv型胶原酶分次静脉灌注和改良密度梯度离心法能有效获得肝脏卵圆细胞，方法简便经济。 3.EGF对于oVc的体外培养生长是必须的，能够通过增加P21ras蛋白的表达够促进OVC的生长。