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长非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)一般是指长度大于200个核苷酸、不具有编码功能蛋白质能力的长链RNA分子。目前研究表明lncRNAs在哺乳动物细胞中发挥着重要功能,比如参与干细胞多能性和重编程、细胞分化、以及生物体发育等多项生命活动的调控。此外,lncRNAs还与人类的一些重大疾病相关,包括癌症、肌肉萎缩等。因此,研究lncRNAs的功能具有重要的意义。 哺乳动物细胞中已知的lncRNAs中大部分在其3味端是含有多聚腺苷酸尾(poly(A) tails)的。为了研究不含有poly(A)尾巴的lncRNAs,我们前期采用Oligo(dT)磁珠分选方法将人源胚胎干细胞H9和宫颈癌细胞HeLa总RNA分成poly(A)+ RNAs(含polyA尾巴)和poly(A)-RNAs(不含polyA尾巴)两种组分,分别建库和高通量测序。在poly(A)-RNAs研究中,前期鉴定了许多内含子来源的lncRNAs,可以稳定地存在于细胞中。 人的15号染色体q11-13区域是印记区域,该区域中的SNURF-SNRPN基因和下游的非编码区域只在父源染色体上表达。与Prader-Willi综合征(Prader-WilliSyndrome,PWS)疾病相关的最短缺失区域(108 kb)位于非编码区,仅包括SNORD109A、含有29个高度同源snoRNAs的SNORD116家族和IPW非编码RNA。最新报道的Prader-Willi综合征模型显示仅SNORD116区域缺失即可导致该疾病发生,而SNORD116家族snoRNAs的分子靶位点还没有发现,目前该疾病的分子机制还不清楚。在poly(A)-RNAs组分中,在SNORD116区域发现了来源于内含子的两端以snoRNA结尾的新类型lncRNA sno-lncRNAs(snoRNA-related lncRNAs)。因此,本博士学位论文以Prader-Willi综合征印记区域发现的新类型的lncRNA sno-lncRNAs为研究对象,结合多种分子生物学、细胞生物学及生物信息学的手段和方法,从Prader-Willi综合征区域sno-lncRNAs的加工成熟机制、功能作用及应用方面进行探索研究。 本博士研究论文第一章研究Prader-Willi综合征区域sno-lncRNAs的加工成熟机制和功能作用。首先,检测了该区域sno-lncRNAs在多种细胞系和组织中的表达情况,证明了sno-lncRNAs的表达具有细胞和组织特异性;其次,通过多种手段证明了Prader-Willi综合征区域sno-lncRNAs来源于内含子,其产生依赖于snoRNP的机制:即含有两个snoRNAs的内含子从pre-RNAs上剪切下来,经脱分支和核酸外切酶降解后,两个snoRNAs中间序列因两侧snoRNPs复合物的保护,形成了一种5端没有帽子结构,3端没有poly(A)尾巴的sno-lncRNAs;最后,通过计算分析和实验证明了Prader-Willi综合征区域sno-lncRNAs位于父源染色体转录位点附近,其中间序列含有多个Fox家族剪接调控因子的结合位点,可以作为“分子海绵”,通过吸附剪接调控因子Fox,进而改变Fox蛋白调节的可变剪接模式。我们提出Prader-Willi综合征疾病可能与该区域sno-lncRNAs的表达缺失相关。 本博士研究论文第二章研究snoVectors载体的构建和应用。许多lncRNAs是在细胞核中发挥功能的,而普通载体经常会导致细胞核RNA运输到胞浆中,阻碍了对细胞核RNA功能的研究。因此,想构建一种新的载体,可以将过表达的RNA滞留在细胞核中。首先,我们根据Prader-Willi综合征区域sno-lncRNAs的分子特征和加工成熟机制构建了RNA表达载体“snoVectors”,并通过Northern Blot等手段验证了该载体可以产生类似的sno-lncRNAs。其次,以lncRNA mNEAT1为例,用Northern Blot、RNA FISH和IF等多种手段研究证明了SnoVectors载体可以将mNEAT1 RNA滞留在细胞核中,定位在paraspeckles中,与p54nrb蛋白共定位,并发挥其生物学功能:即滞留3 UTR含有IRAlus(inverted repeated Alu elements)的mRNA于paraspeckles中。第三,研究发现snoVectors载体可以将其他类型RNA,如内含子序列、mRNA的编码区域、其他lncRNAs等,滞留在细胞核中。最后,snoVectors载体还可以用于过表达microRNAs和筛选稳定表达细胞株。因此,snoVectors载体作为研究工具在研究细胞核RNA功能和RNA需要避免运输到胞浆的研究中发挥积极作用,促进lncRNA功能等的研究。