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目的:线粒体是细胞内主管能量代谢的细胞器,同时也参与细胞凋亡、氧化应激反应以及维持钙稳态。近年来,人们逐渐认识到损伤的线粒体可以释放多种组分,即线粒体DAMPs(damage associated molecular parttens,DAMPs),通过与免疫细胞或实质细胞的模式受体(pattern related receptor,PRR)结合,介导炎症损伤。已知肾脏浸润免疫细胞以及肾脏实质细胞广泛表达各种PRR以及创伤、烧伤患者线粒体DAMPs会大量释放到循环中,尤为重要的是这些患者常常伴有肾脏损伤。为此,本研究拟探讨线粒体DAMPs与肾脏损伤的关系以及建立检测线粒体DAMPs水平方法,并探讨其在肾脏疾病诊断中的应用。方法:研究分两部分。第一部分:线粒体DAMPs与肾脏损伤的关系。制备线粒体DAMPs:利用PCR扩增已被证实具有免疫活性mtDNA(mitochondrial DNA,mtDNA)片段制备mtDNA。采用蔗糖梯度离心法提取动物肝脏线粒体,超声破碎,获得线粒体碎片可溶物(mitochondrial debris,MTD)。体内动物实验:通过尾静脉注射外源mtDNA以及MTD,注射后不同时间点收集Balb/c小鼠、SD大鼠尿、血标本,留取肾脏、肺脏病理标本,检测尿蛋白、血肌酐、外周血中性粒细胞比例,观察肾脏、肺脏光镜病理改变。体外细胞实验:利用mtDNA、MTD刺激培养的人足细胞系,免疫印迹检测p38的活化情况。第二部分:基于实时PCR的线粒体DNA拷贝数检测方法的建立及其在肾脏疾病诊断中的应用。设计mtDNAPCR扩增引物,PCR扩增获得mtDNA片段,与T载体质粒连接,构建mtDNA定量标准品。采用SYBR Green I染料法实时定量PCR方法建立mtDNA定量的标准曲线,检验定量方法的重复性与特异性。利用所建立的方法检测局灶节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者血清mtDNA和尿液微囊泡(microvessicles,MVs)mtDNA的变化;此外,还对体外嘌呤霉素氨基核苷(PAN)刺激的足细胞所分泌的MV中mtDNA进行了检测。结果:第一部分:(1)外源注射mtDNA因易被降解,只能诱导Balb/C小鼠产生瞬时、微量蛋白尿;(2)少量(1-5%肝脏)注射线粒体DAMPs不能诱导Balb/C小鼠蛋白尿的产生,但可使肺泡间质轻度增宽,少量单个核细胞浸润;(3)注射大量(30%肝脏)线粒体DAMPs可引起SD大鼠急性炎症反应,肺脏轻度渗出性改变,局灶肾小管刷状缘脱落,并在炎症极期产生瞬时蛋白尿;(4)体外mtDNA、MTD刺激人足细胞,激活TLR9下游P38MAPK通路。第二部分:(1)选取mtDNA特异性引物,通过SYBRGreenI实时PCR建立mtDNA拷贝数绝对定量的检测方法具有良好的特异性,灵敏性和重复性;(2)检测10例FSGS患者和6例正常对照血清mtDNA水平,发现FSGS患者血清mtDNA水平明显低于正常对照(P<0.05);(3)检测5例FSGS患者与5例健康对照一定体积尿液中MV mtDNA含量,发现FSGS患者高于健康对照,但FSGS患者尿液MV的含量也显著高于健康对照;(4)受PAN刺激的足细胞,其分泌的MV中mtDNA含量下降,与足细胞内mtDNA含量变化相一致。结论:(1)缺乏机体应激状态应有的免疫功能的改变前提下,循环中线粒体DAMPs单纯性升高,不能完全解释创伤、烧伤后等蛋白尿的现象;(2)肾脏疾病可能与mtDNA水平的变化相关联,因此,血清,血浆,尿液,肾组织细胞中的mtDNA有可能成为肾脏疾病的生物标志物。