【摘 要】
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目的:探讨PFOS致SK-N-SH细胞的损伤作用及潜在毒性机制,为进一步研究PFOS的神经毒性提供实验依据和理论基础。 方法:根据前期实验,将实验分为实验组(50、100、150、200、250μM
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目的:探讨PFOS致SK-N-SH细胞的损伤作用及潜在毒性机制,为进一步研究PFOS的神经毒性提供实验依据和理论基础。 方法:根据前期实验,将实验分为实验组(50、100、150、200、250μM)和对照组(DMSO)。不同浓度PFOS处理SK-N-SH细胞24h、48h或72h后,MTT法检测细胞活性,计算PFOS处理SK-N-SH细胞48h后的半数抑制浓度。光学显微镜下观察PFOS对SK-N-SH细胞的形态学改变;流式细胞仪检测SK-N-SH细胞的凋亡和细胞周期。碱性彗星实验观察PFOS对SK-N-SH细胞的DNA损伤情况;亚硫酸盐测序分析PFOS引起的BDNF启动子区域甲基化的改变;ELISA检测PFOS对BDNF蛋白的改变。Q-PCR检测BDNF相关miRNA(miRNA-16、miRNA-22、miRNA-30a-5p)、DNMTs以及相关的周期蛋白CDK2、CyclinE和AkT、GSK-3β的mRNA水平。Western Blot法检测DNMTs和AkT、GSK-3β、CDK2、CyclinE、Bcl-2、Bax的蛋白水平。 结果:MTT结果显示PFOS能导致SK-N-SH细胞活性的降低,暴露48h,PFOS能导致SK-N-SH细胞的活性呈浓度依赖性降低。PFOS还能引起了SK-N-SH细胞的形态学改变,细胞的突触变短,甚至整个细胞变圆;流式细胞术结果显示PFOS导致SK-N-SH细胞发生凋亡,且发生了细胞周期的阻滞,并阻滞在G1期。碱性彗星实验表明PFOS能导致SK-N-SH细胞发生DNA损伤;亚硫酸盐测序结果显示,PFOS暴露引起的BDNF启动子Ⅰ和Ⅳ的高甲基化;ELISA结果表示PFOS降低了BDNF蛋白的表达,Q-PCR结果也显示BDNF的mRNA的表达水平降低。然而,在抑制剂IGF、LiCl、NAC预处理之后BDNF的表达显著增加。Q-PCR结果显示PFOS显著增加了miRNA-16、miRNA-22、miRNA-30a-5p的mRNA的表达,降低了DNMT1的mRNA表达,同时增加了DNMT3b的mRNA表达。Western Blot结果显示DNMT1蛋白水平降低,DNMT3b的蛋白水平增加。根据Western Blot结果显示PFOS降低了Akt和GSK-3β磷酸化水平,增加Bax但是降低了Bcl-2的表达。 结论:1.PFOS致SK-N-SH细胞活性呈剂量依赖关系下降,并能导致细胞形态学改变。 2.PFOS能降低SK-N-SH细胞BDNF的表达,可能与PFOS改变BDNF启动子区域(Ⅰ、Ⅳ)的高甲基化状态和BDNF相关miRNA(miRNA-16、miRNA-22、miRNA-30a-5p)表达升高有关。 3.PFOS能导致SK-N-SH细胞DNA损伤和细胞周期阻滞。 4.BDNF/Akt/GSK-3β通路介导了PFOS致SK-N-SH细胞损伤的作用。
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