非蛋白质氨基酸由于其结构与功能的多样性,在化工、医药、农药、食品以及化妆品等领域均有广泛的用途。但制备非蛋白质氨基酸、特别是制备手性纯的非蛋白质氨基酸一直以来是工业界的难题。相比于化学合成和手性拆分,酶催化不对称合成具有立体选择性严格、反应条件温和以及过程绿色等优点,是制备手性非蛋白质氨基酸的优势方法。在酶催化不对称合成氨基酸的应用中,转氨酶（transaminase,EC 2.6.1.X）和氨基酸脱氢酶（amino acid dehydrogenase,EC 1.4.1X）是使用最为广泛的两类生物催化剂。转氨酶具有种类繁多、底物谱广、催化活力高、立体选择性好等优点;但转氨酶最大的缺点是其催化的反应可逆、需要使用过量的氨基供体。与之相反,氨基酸脱氢酶催化的反应是不可逆的,但其种类少、底物通常仅限于蛋白质氨基酸,在合成非蛋白质氨基酸时,其催化活力和选择性通常达不到要求。针对上述问题,我们开发了一种级联反应体系,该体系包含三种自然存在的酶:（1）转氨酶以常见的氨基酸为氨基供体,催化底物生成非蛋白质氨基酸产品;（2）氨基酸脱氢酶在消耗氨和辅酶NAD（P）H的同时,催化转氨反应的副产物酮酸循环再生为转氨酶的氨基供体,从而推动转氨反应趋向完全;（3）醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,EC 1.1.1.X）以廉价的异丙醇为原料、循环再生辅酶NAD（P）H。此方法旨在结合转氨酶和氨基酸脱氢酶的优点,并克服二者的缺点。为此,我们首先对转氨酶、氨基酸脱氢酶和醇脱氢酶这三类酶分别进行了克隆表达与筛选。其中,对14种不同来源、不同类型的转氨酶进行筛选,获得了一个包含5种L-转氨酶和3种D-转氨酶的酶库,用于多样化的非蛋白质氨基酸的制备;由于不同的转氨酶需要不同的氨基酸作为氨基供体,因此,我们从15种氨基酸脱氢酶中筛选出5种天然底物不同的、高酶活的氨基酸脱氢酶,用于转氨酶氨基供体的原位再生。此外,我们从8种醇脱氢酶中筛选出2种,分别用于辅酶NADH和NADPH的循环再生。对这三类酶的典型代表,γ-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶、嗜芽孢杆菌来源的醇脱氢酶进行了酶学性质研究,为三酶级联反应参数的优选提供参考。在筛选得到转氨酶、氨基酸脱氢酶和醇脱氢酶的基础上,构建了用于制备手性非蛋白质氨基酸的三酶级联反应。根据各种酶的底物特异性,将酶进行组合,通过不同的酶组合催化制备了五种L-构型的非蛋白质氨基酸:L-正缬氨酸、L-叔亮氨酸、L-草铵膦、L-噻吩丙氨酸、L-高苯丙氨酸,以及四种D-构型的非蛋白质氨基酸:D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸。反应过程中转氨酶氨基供体的使用浓度为0.1 mM,仅为原料氨基受体（10 mM）的1%,原料转化率和产品的对映体过量值（ee值）都超过99%。综上所述,本课题构建的三酶级联反应体系,为制备手性非蛋白质氨基酸提供了一种适用范围广、催化效率高、过程绿色的方法。