食管癌是我国高发的恶性肿瘤之一,其中河南省太行山区林州市人群中的食管癌发病率位居世界首位。我国食管癌以食管鳞癌为主,侵袭性强,预后差,临床进展迅速,多伴有淋巴结转移,且易复发,5年生存率仅为10%左右。Caveolin-1(Cav-1)是胞膜窖标志性蛋白质之一,主要通过脚手架结构域(Caveolin-1 Scaffording Domain,CSD)、跨膜结构域以及Y14位点等与其它蛋白相互作用,来调节多种信号传导分子和通路的活性,从而影响细胞的分化、增殖、迁移和凋亡等。不少研究表明,Cav-1在肿瘤细胞转化、肿瘤生成和转移等病理过程中起着非常重要的作用,其不仅在多种肿瘤中表达异常,而且在不同肿瘤中具有不同的作用和机制。如在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌中Cav-1呈低表达状态,可能是人类肿瘤抑制因子;而在前列腺癌、膀胱癌中Cav-1则过度表达,充当癌基因的作用。目前,Cav-1及其调控的下游信号传导途径已成为肿瘤研究的热点之一。研究发现,Cav-1在癌旁组织及食管鳞状细胞癌组织中表达量升高,具有促进食管鳞癌发生的作用,但目前鲜少有Cav-1与ESCC多药耐药之间相关性的研究报道。因此为弥补该方面研究的欠缺,本实验对食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织及正常食管组织中Cav-1、P53、BDNF、P-gp、MRP1和β-catenin的表达进行检测,分析食管鳞状细胞癌发生过程中Cav-1与五者间的相关性;采用cav-1基因超表达方法进一步提高Cav-1食管鳞癌细胞Ec9706中的表达,分析Cav-1的高表达对癌细胞多药耐药性相关蛋白表达和药物外排的影响;最后采用sh RNA干扰技术抑制Ec9706细胞中cav-1基因的表达,进一步检测Cav-1的降低表达对食管鳞癌细胞多药耐药性蛋白表达和药物外排的影响。上述研究不仅为食管癌发生发展机制的研究提供新的思路和为其临床治疗提供新的靶点,还可为降低ESCC患者多药耐药性提供科学依据。第一部分Caveolin-1及多药耐药相关蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及相关性分析方法1.免疫组织化学法检测86例食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织和癌旁正常食管粘膜组织中Cav-1、P53、P-gp、MRP1、β-catenin和BDNF蛋白的表达情况。2.统计学处理:SPSS21.0软件统计软件包进行分析,两个变量之间的相关性检验用Spearman相关分析,两分类变量的比较用Pearson’sχ2检验;以P≤0.05为差异有统计学意义。结果1.免疫组织化学法结果显示:Cav-1蛋白在癌旁正常食管组织、癌旁组织及食管鳞状细胞癌组织中主要分布于细胞质和细胞膜,阳性表达率依次升高,分别为15.11%、38.37%、61.63%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.多药耐药相关蛋白免疫组织化学法结果显示:MRP1、P-gp、P53蛋白在正常食管组织、癌旁组织及食管鳞状细胞癌组织中阳性表达率依次升高,分别为17.44%、39.53%、63.95%,22.09%、44.18%、72.09%,9.30%、46.51%、59.30%,各蛋白组间差异具有统计学意义(P<0.05)。BDNF蛋白在正常食管组织、癌旁组织及食管鳞状细胞癌组织中阳性表达率依次升高,为6.98%、10.47%、18.6%,但各蛋白组间比较无显著差异(P>0.05)。β-catenin蛋白在正常食管组织、癌旁组织及食管鳞状细胞癌组织中高表达,其阳性表达率基本无变化,但在核质中的阳性表达率分别为8.14%、52.32%、80.23%,有明显的统计学意义(P<0.05)。3.经SPSS21.0检验分析,食管鳞癌组织中Cav-1与P-gp、MRP1、P53具有明显的正相关性(γ分别为0.77、0.453、0.581;P均为0.000),而与BDNF的表达相关性不明显(γ=0.000;P=0.391);此外,Cav-1的表达虽与β-catenin的整体表达没有明显的相关关系,但与细胞核质表达的β-catenin有一定的相关性(γ=0.003;P=0.000)。第二部分Caveolin-1表达对食管鳞癌细胞多药耐药相关蛋白的影响方法1.通过超表达cav-1基因和载体介导的RNA干扰技术来研究食管鳞癌细胞Ec9706中多药耐药相关基因的表达,运用RT-PCR和Western blots检测基因超表达是否成功和RNA干扰效率。2.运用RT-PCR和Western blots检测超表达cav-1基因和RNA干扰前后Ec9706细胞中MRP1、P-gp、P53、BDNF、β-catenin的m RNA和蛋白质表达变化。3.应用药物外排实验检测超表达cav-1基因和RNA干扰前后Ec9706细胞外排Calcein AM和Rhodamine123的变化,采用荧光显微镜拍照。4.统计学处理:采用SPSS21.0软件统计软件包进行分析。统计学数据用均数±标准差表示,两样本均数比较采用t检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),Western blots灰度值及荧光强度应用Image-Pro Plus6.0进行分析。以α=0.05为检验水准。结果1.cav-1基因超表达和si RNA干扰表达质粒构建成功:与对照组相比,转染后48h和72h超表达组中cav-1基因m RNA相对表达量分别为221.46±25.14,290.13±43.36,蛋白质相对表达量为3.19、5.97,表达量均显著增加(P<0.01)。表明cav-1基因超表达质粒构建成功。与对照组相比,转染P3-1和P3-3质粒的细胞中cav-1基因m RNA和蛋白质表达量没有明显改变(P>0.05),而转染P3-2质粒的实验组表达量显著下降(P<0.01),即cav-1基因m RNA相对表达量降为0.454±0.17,蛋白质相对表达量降为0.52。表明构建成功的si RNA质粒为P3-2。2.cav-1基因表达水平改变对ESCC细胞中多药耐药相关蛋白P-gp、MRP1、P53、BDNF、β-catenin表达的影响:(1)cav-1基因表达水平改变对P-gp表达的影响:cav-1基因超表达48h和72h的Ec9706细胞中P-gp m RNA和蛋白相对表达量为0.84±0.31、0.72±0.20和1.01、0.91,虽然其表达量有少许降低,但并没有显著统计意义(P>0.05);干扰cav-1表达72h的Ec9706细胞中P-gp m RNA和蛋白相对表达量为0.56±0.07、0.71,表达量显著降低(P<0.05)。(2)cav-1基因表达水平改变对MRP1表达的影响:cav-1基因超表达48h和72h的Ec9706细胞中MRP1 m RNA和蛋白相对表达量为1.58±0.18、3.55±0.21和1.76、3.51,表达量显著增加(P<0.05);干扰cav-1表达72h的Ec9706细胞中MRP1 m RNA和蛋白相对表达量为0.33±0.09、0.62,表达量显著降低(P<0.05)。(3)cav-1基因表达水平改变对P53表达的影响:cav-1基因超表达48h和72h的Ec9706细胞中P53 m RNA和蛋白相对表达量为0.90±0.13、2.30±0.11和1.14、0.95,m RNA表达量在72h显著增加(P<0.05),但蛋白质表达量几乎不改变;干扰cav-1表达72h的Ec9706细胞中P53 m RNA和蛋白相对表达量为0.63±0.14、0.42,表达量显著降低(P<0.05)。(4)cav-1基因表达水平改变对β-catenin表达的影响:cav-1基因超表达48h和72h的Ec9706细胞中β-catenin m RNA和蛋白相对表达量为0.98±0.10、1.27±0.07和1.20、0.98,表达量改变不显著(P>0.05);干扰cav-1表达72h的Ec9706细胞中β-catenin m RNA和蛋白相对表达量为0.92±0.08、0.89,表达量无明显改变(P>0.05)。(5)cav-1基因表达水平改变对BDNF表达的影响:Ec9706细胞中并没有检测到BDNF基因和蛋白质的表达。在cav-1基因超表达和降低表达的Ec9706细胞中,同样未检测到BDNF m RNA和蛋白质的表达。3.细胞外排Calcein AM和Rhodamine123研究:超表达cav-1 48h和72h的细胞中Calcein AM的荧光强度分别为852322.6±211.2、827510.3±1567.5,与对照组细胞(1364586.8±589.2、1445295.3±1134.6)相比,Calcein AM荧光强度明显降低(P<0.01);相反,与对照组细胞(434570.1±1854.2、470330.8±3234.6)相比,超表达cav-1 48h和72h的细胞中Rhodamine123的荧光强度没有明显改变(P>0.05),其荧光强度分别为412125±2175.4、403155.4±562.8。cav-1敲低表达的细胞中Calcein AM的荧光强度分别为1757270.7±7650.1,与对照细胞(1293502.9±1729)相比,Calcein AM荧光强度明显升高(P<0.01);同样,与对照细胞(464069.4±2256.5)相比,cav-1敲低表达的细胞中Rhodamine123的荧光强度亦明显升高(P<0.01),其荧光强度为687517.4±692.7。结论1.Cav-1、MRP1、P-gp、P53的表达与食管癌的发生发展密切相关,上述四者的表达上调可能促进食管鳞癌的发生发展;β-catenin的表达与食管癌变之间无明显相关性,但其从细胞膜到细胞核、细胞质的定位变化可能与食管癌的发生发展密切相关。2.食管鳞癌中,Cav-1的表达分别与P-gp、MRP1、P53表达具有明显的相关关系,但与BDNF、β-catenin的表达相关性不明显。3.cav-1上调表达基本上不影响P-gp和P53 m RNA和蛋白质表达,但低表达可降低P-gp和P53 m RNA和蛋白质的表达水平,提示Cav-1在食管鳞癌细胞中对P-gp和P53表达的调节作用可能存在剂量效应。4.食管鳞癌的耐药性改变与Cav-1表达水平密切相关:Cav-1表达水平改变显著影响多药耐药相关基因和蛋白即P-gp和MRP1的表达水平,从而改变食管鳞癌细胞对药物的外排作用。因此,Cav-1可作为一个有效的逆转食管鳞癌多药耐药的相关靶点。