【摘 要】
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目的:该研究通过HepG2人肝癌细胞和60 kcal%高脂饲料诱导的糖尿病小鼠为研究对象,探索科罗索酸（Corosolic acid,CA）通过AMPK信号通路调控肝脏糖异生的作用机制,为开发以AMPK为分子靶标的抗糖尿病药物CA提供理论参考。方法:体外细胞实验:HepG2人肝癌细胞分别处理0、5、10、20μM的CA24 h,通过MTT细胞毒性实验,测定细胞生存率。将0、5、10、20μM CA
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目的:该研究通过HepG2人肝癌细胞和60 kcal%高脂饲料诱导的糖尿病小鼠为研究对象,探索科罗索酸（Corosolic acid,CA）通过AMPK信号通路调控肝脏糖异生的作用机制,为开发以AMPK为分子靶标的抗糖尿病药物CA提供理论参考。方法:体外细胞实验:HepG2人肝癌细胞分别处理0、5、10、20μM的CA24 h,通过MTT细胞毒性实验,测定细胞生存率。将0、5、10、20μM CA（药物溶解在不含有血清的DMEM培养液中）处理细胞3 h,PBS洗两次,再次加入不含有血清、酚红和葡萄糖的DMEM培养基（含有2 mM丙酮酸钠、20 mM乳酸钠、50 nM地塞米松、100 μM cAMP环磷酸腺苷）培养3 h。收集细胞培养液,测定糖生成水平,收集细胞,通过蛋白印迹实验（western-blot）测定LKB1、AKT、AMPK、ACC、CREB和GSK-3β等蛋白的表达,通过聚合酶链式反应（RT-PCR）测定PEPCK、G6pase、FOXO1和PGC-1α等糖异生相关基因mRNA的表达。细胞处理AMPK抑制剂（compound C）、AMPK激活剂（AICAR）、AKT抑制剂（LY294002）以及Akt激活剂（胰岛素）后检测了上述指标。体内动物实验:以C57BL/6j雄性小鼠为研究对象,普通饲料饲养1周适应环境后分为五组,正常对照组（CON）、模型组（HFD）、CA 低剂量组（CAL,10 mg/kg CA）、CA 高剂量组（CAH,20mg/kg CA）和阳性对照组（MET,300mg/kg二甲双胍）。CON组用10 kcal%的饲料喂养,其他四组均用60 kcal%高脂饲料,共喂养8周,喂养4周后小鼠进行灌胃给相应剂量的药物,对照组（CON）和模型组（HFD）给予0.5%的羟甲基纤维素钠（CMC）溶液,药物溶解在0.5%的CMC溶液中,每天灌胃给药一次,共4周。实验结束后,小鼠进行了 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和腹腔丙酮酸钠耐量试验（IPPTT）;通过western-blot实验检测了 LKB1、AMPK、ACC、Akt和GSK-3β等蛋白质表达;通过RT-PCR实验检测了 PEPCK、G6pase、FOXO1和PGC-1α等基因表达。结果:CA在0-20 μM对HepG2细胞没有细胞毒性,因此我们选用0-20 μM浓度进行了后续的实验。细胞处理0、5、10、20μM的CA时,CA浓度依赖性地抑制了 HepG2细胞葡萄糖生成,与未处理CA时相比,葡萄糖生成量分别降低了3.5%、12.9%和27.1%。CA以时间和浓度依赖性地激活了 LKB1、AMPK、ACC、Akt和GSK-3β蛋白质的磷酸化,相反,CREB蛋白磷酸化水平以时间和浓度依赖性地降低。CA时间和浓度依赖性地下调了 PEPCK、G6pase、FOXO1、PGC-1α等糖异生相关基因的表达。当细胞处理compound C或LY294002处理后,这些作用都被逆转。在动物实验中,与模型组相比较,CA浓度依赖性地显著降低了葡萄糖和丙酮酸盐引起的血糖升高。CA浓度依赖性地激活了小鼠肝脏组织中AMPK、LKB1、ACC、Akt和GSK-3β蛋白质的磷酸化,同时CA浓度依赖性地降低了小鼠肝脏组织中PEPCK、G6pase、FOXO1和PGC-1α基因mRNA的表达。结论:CA通过激活LKB1/AMPK/Akt信号通路来调节肝脏糖异生。
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