【摘 要】
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目的:制备具有较高转染效率和较低细胞毒性的脂质聚阳离子基因载体,脂质-聚乙烯亚胺-山梨糖醇二丙烯酸酯（LP-PSDA）,并对其进行体外评价及细胞内吞机制的研究。方法:采用乙醇扩散法制备阳离子脂质体LP,将其与不同质量的山梨糖醇二丙烯酸酯接枝的聚乙烯亚胺（PSDA）及DNA混合制成LP-PSDA/DNA纳米复合物。以纳米复合物压缩DNA的能力、细胞存活率及转染效率作为评价指标筛选PSDA的最佳用量。
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目的:制备具有较高转染效率和较低细胞毒性的脂质聚阳离子基因载体,脂质-聚乙烯亚胺-山梨糖醇二丙烯酸酯（LP-PSDA）,并对其进行体外评价及细胞内吞机制的研究。方法:采用乙醇扩散法制备阳离子脂质体LP,将其与不同质量的山梨糖醇二丙烯酸酯接枝的聚乙烯亚胺（PSDA）及DNA混合制成LP-PSDA/DNA纳米复合物。以纳米复合物压缩DNA的能力、细胞存活率及转染效率作为评价指标筛选PSDA的最佳用量。采用Zeta电位粒度测定仪测定LP-PSDA/DNA纳米复合物的粒径及Zeta电位,透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察其形态。测定纳米复合物在血清中的透光率,评价其在血清中的稳定性。通过研究细胞内吞抑制剂和质子泵抑制剂对LP-PSDA/DNA纳米复合物转染效率的影响,探索细胞摄取及转染的机制。并以程序性死亡因子4（pdcd4）为模型药物,考察LP-PSDA/pdcd4在SPC-A1细胞中的表达,评价其对治疗基因的传递效果。结果:LP-PSDA/DNA复合物的粒径均小于200 nm,Zeta电位为6.93～25.99 mV,形态呈球形或类球形。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,不同质量比的LP-PSDA均能与DNA紧密结合。细胞毒性实验结果表明,在人肺腺癌细胞SPC-A1和人肺癌细胞A549中的细胞存活率是随着PSDA用量的增加而降低（96%～83%）。细胞转染实验结果显示,PSDA质量为0.5 μg时,LP-PSDA/pGL3-N2在SPC-A1和A549细胞中的细胞转染效率显著高于LP/pGL3-N2 组和阳性对照组 lipofectamin2000/pGL3-N2（n=3;**p＜0.01）。因此LP-PSDA/DNA的最优处方为LP:PSDA:DNA=10:0.5:1（WR）。血清稳定性实验结果表明,纳米复合物的透光率随着FBS浓度增加而降低,在含有50%的FBS培养基中透光率降低最为明显为5%。细胞内吞途径结果显示:LP-PSDA/pGL3-N2组主要是通过网格蛋白介导的内吞途径以及小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。载体转染机制研究表明,纳米复合物通过质子海绵效应从内涵体中逃逸以提高转染效率。Western Blot实验结果显示LP-PSDA/pdcd4组的PDCD4蛋白,及细胞凋亡相关蛋白BAD和BAX的表达显著高于LP/pdcd4组（n=3;***P＜0.001）,表明脂质聚阳离子基因载体LP-PSDA可有效地传递基因pdcd4,进一步说明LP-PSDA的转染效率高于LP组。结论:本实验成功制备了具有低毒性和高转染效率的脂质聚阳离子基因载体LP-PSDA,高分子基因载体PSDA可有效地提高基因载体LP的转染效率。
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