【摘 要】
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多肽的末端功能化修饰对其生物活性影响巨大,其中C端酰胺化修饰不仅能提高其稳定性,延长药物半衰期,还能够显著提高其生物活性。从嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia,S.maltophilia）中分离的肽酰胺酶（Peptide Amidase,PAM,EC 3.5.1.4）属于丝氨酸水解酶类,对多肽C端具有高度区域选择性,而该酶在原产菌的低产率及酰胺化修饰的低活性
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多肽的末端功能化修饰对其生物活性影响巨大,其中C端酰胺化修饰不仅能提高其稳定性,延长药物半衰期,还能够显著提高其生物活性。从嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia,S.maltophilia）中分离的肽酰胺酶（Peptide Amidase,PAM,EC 3.5.1.4）属于丝氨酸水解酶类,对多肽C端具有高度区域选择性,而该酶在原产菌的低产率及酰胺化修饰的低活性限制了其实际应用。本文构建了大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表达系统实现肽酰胺酶的重组表达,并通过半理性改造显著增加该酶的酰胺化合成反应活性,主要研究结果如下:（1）建立了肽酰胺酶的大肠杆菌重组表达系统。来源于S.maltophilia肽酰胺酶12突变体（下称PAM12A）具有较强的热稳定性及有机溶剂耐受性,故选择其作为本研究的出发研究对象。从PDB（Protein Data Bank）数据库中获得其氨基酸序列（PDB登录号5AC3）,设计并委外合成质粒p ACYCDuet-1-pam,同时构建重组载体p RSFDuet-1-pam,转入E.coli Rosseta2（DE3）,确定p RSFDuet-1-pam作为后续表达载体。通过优化,得到最佳诱导条件为:E.coli Rosseta2（DE3）/p RSFDuet-1-pam生长至OD600 0.8,加入IPTG至0.4 m M,37℃下诱导20 h。（2）为了提高PAM12A的酰胺化合成活性,基于组合活性中心饱和试验（Combinatorial active-site saturation test,CAST）与迭代饱和突变（Iterative saturation mutagenesis,ISM）策略进行半理性改造,获得高活性突变体N141G/S147G/S149D/F437Y/E440F/Y442G（统称PAM18）。首先使用Pymol对PAM12 A的活性口袋进行分析,依据CAST原理选择活性口袋10?范围内、氨基酸残基侧链朝向口袋内侧且在空间结构上相互靠近的5组关键改造位点,即S137/N141、S147/S149、V197/P199、D435/F437、E440/Y442。然后通过迭代饱和突变筛选得到比活力为345.16±10.97 U?mg-1的最优突变体PAM18,其比活力为出发菌株的191%。对PAM18的结构分析结果表明,其反应活性的提升机理可能是由于第141、147、442位小体积氨基酸甘氨酸的引入导致口袋部位位阻减小,底物更容易与酶活性口袋结合。酶学性质研究表明,PAM12A及其PAM18的最适反应温度均为50℃;PAM18的热稳定性与出发株PAM12 A相比虽有一定程度下降,但在65℃以下的温度孵育1 h时相对活性仍能维持在较好的水平,说明酶的热稳定性依旧良好;以Z-Gly-Tyr-OH为合成反应底物,突变体PAM18的Km值为3.54μM,较PAM12A降低32%,说明PAM18与底物的亲和力增加。PAM18的Kcat/Km达到PAM12A的143%,表明PAM18的催化性能较出发菌株得到明显提高。本论文通过分子改造显著提高了肽酰胺酶的酰胺化合成活性,对后续酰胺酶的功能化分子改造和应用其进行肽类药物中间体的酰胺化修饰具有重要的意义。
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