基因组编辑(Genome editing)是对生物基因组进行靶向修饰的一项新技术。该技术通过利用人工构建的序列特异核酸酶(Sequence-specific nucleases，SSNs)在基因组靶位点制造DNA双链断裂切口进而诱导细胞内DNA修复机制，通过非同源末端连接(Non-homologous end joing，NHEJ)或同源重组(Homologous recombination，HR)实现基因定点突变、删除、替换和插入等操作。锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspersed shortpalindromic repeats(CRISPR)/Cas9)是目前广泛应用的序列特异核酸酶。本研究以水稻和二穗短柄草为研究对象，成功建立了植物ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术体系，并以OsBADH2基因为代表探索了基因组编辑技术在水稻分子设计育种中的应用。研究取得以下主要结果:　　一、ZFNs是最早被用于基因组编辑研究的。我们针对报告基因GFP、GUS及水稻和二穗短柄草内源基因设计了23对ZFNs;利用酵母实验筛选获得7对ZFNs具有DNA切割活性;这些ZFNs分别转化到相应的植物材料中，T0代转基因植物中获得1株GFP基因敲除突变体，效率为1.4％，但其余ZFNs均未产生突变植物，ZFN在植物中的效率有待提高。　　二、为建立二代基因组编辑工具TALEN在植物中的技术体系，以水稻和二穗短柄草OsBADH2、OsCKX2和OsDEP1等10个与产量及品质等性状相关的内源基因为靶标，利用Golden Gate Assembly方案设计并构建28对TALENs，原生质体瞬时表达实验表明有15对TALENs(＞50％)具有突变活性，涵盖全部10个基因。原生质体中突变效率为4-20％，水稻愈伤突变效率在3.8-61.7％之间，二穗短柄草愈伤中突变效率达到7.4-37.5％。此外，基因枪法共同转化靶向水稻OsBADH2基因的两对TALENs，获得1.3kb基因片段删除转基因株系（效率为5.1％）。通过共同转化靶向水稻OsBADH2、OsCKX2和OsDEP1基因的3对TALENs，在T0代获得一系列单基因、两基因及三基因共同敲除转基因株系，其中三基因共同敲除突变效率达到1.9％(4/207)。　　三、最新的CRISPR/Cas9系统利用碱基互补配对方式将导向RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶靶向基因组特定位点。为建立植物中的CRISPR/Cas9基因组编辑体系，首先对链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶(SpCas9)进行水稻偏爱密码子优化并添加核定位信号序列NLS;扩增水稻小核RNA U3启动子，构建以35S∷OsCas9和OsU3∷sgRNA为主要元件的的水稻CRISPR/Cas9表达系统，以提高其表达及转录水平。选取OsBADH2、OsPDS和OsDEP1三个水稻基因共设计17个sgRNAs，在原生质体中瞬时表达并检测sgRNA活性，结果表明有8个sgRNA具有突变活性，突变效率为14.5-38％之间。利用基因枪法转化水稻，转基因植物中的突变效率达到7.1-9.4％，并且在T0代即获得纯合水稻pds突变体，突变体呈现全株白化矮小表型。此外，在水稻原生质体中共同转化Cas9，sgRNA和单链供体DNA模板，利用同源重组(HR)修复方式，实现12bp DNA片段（包含两限制性内切酶位点）精确插入。　　四、为将基因组编辑技术真正应用到作物农艺性状的改良上，我们选用水稻稻米香味负调控基因OsBADH2作为研究对象。利用TALEN技术敲除OsBADH2基因，在T1代获得纯合badh2突变株系。所有株系均具有香味表型，用GC-MS检测稻米中芳香主成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)含量表明:纯合badh2突变体比对照品种日本晴(无香味)2AP含量显著增加，达到0.35-0.8mg/kg，与香米品种稻花香2AP含量相当。通过自交分离可以将TALEN转基因载体完全分离，这些香米株系与日本晴基因型完全相同，只在OsBADH2基因靶位点处缺失一个核苷酸。对基因突变进行多世代遗传分析表明TALEN诱导的突变可以稳定遗传给后代。　　通过在水稻和二穗短柄草中对三类SSNs的设计、构建、活性检测、稳定转化及后代遗传分析等相关研究，我们成功地构建了植物ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术体系。此外，以SSNs为工具对水稻进行了农艺性状改良，将此技术应用到作物精确分子育种上。其中，ZFN和TALEN均为在水稻和二穗短柄草中首次应用，并原创性建立了植物CRISPR/Cas9体系，以上研究为植物基因功能研究及分子遗传改良提供了有力的工具。