原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤第二位。尽管近年来肝癌的外科治疗获得了令人注目的成就，但对晚期肝癌及术后广泛复发和转移的患者仍无满意的手术方式。肝癌的非手术治疗主要有化疗、放疗、免疫治疗、中医治疗、射频和微波消融等，目前这些治疗的效果还不甚理想。因此要进一步提高肝癌的治疗效果，需要引入一种崭新机制的治疗手段。近年来随着肿瘤学、分子生物学和病毒学的发展，基因治疗正逐步进入临床，以其独特的治疗机制为肝癌治疗提供一种新的选择。 腺病毒能够感染分裂和非分裂期的细胞。腺病毒E1基因复合体的表达对它的感染起重要作用。E1基因复合体包括E1A和E1B基因。E1A结合和抑制pRB，为病毒增殖创造良好的细胞内环境。病毒的复制能激发p53通路诱导细胞凋亡或细胞周期停滞，从而中断病毒的感染；而E1B—55kD能结合和抑制p53蛋白，保证病毒顺利复制并裂解细胞。肿瘤细胞的pRB和p53基因经常发生突变或缺失；因此E1A或E1B基因缺陷的腺病毒仍可分别在这些肿瘤细胞中选择性复制，但在pRB和p53途径完好的正常细胞中的复制减弱。 H101是上海三维生物有限公司构建并获得国家专利的重组腺病 浙江大学博士学位论文毒。H101的口 基因编码55kDa 蛋白的序列缺失；因此它在p53 基因突变的癌细胞中仍可表现出很强的细胞毒性作用，而在正常细胞中它的复制被大大抑制。H101肿瘤增殖的选择性使它有望成为一种新的肿瘤治疗药物。目前H101 已经进入临床试验阶段，但主要集中在体表肿瘤的治疗，而对于深部肿瘤如肝癌、胃癌、结肠癌和食道癌的治疗尚属空白。文献报道肝癌 p53 基因的突变率达30－50％。p53基因的突变与肝癌分化、侵袭性、门静脉癌栓、转移能力与预后有密切相关性，因此针对肝癌的p53 基因治疗对改善肝癌的预后有重要意义。本文拟就mol对体外、体内肝癌细胞生长的抑制作用及其与 中 突变的关系进行研究：同时将阿霉素与H101联用，探讨两者在杀伤肝癌细胞时的协同作用。全部研究包括以下三部分。第一部分：重组腺病毒H101对体外肝癌细胞生长抑制的实验研究目的：研究H101对体外肝癌细胞生长的抑制作用与细胞株p53 基因突 变的关系，探讨H101的抑制作用与肝癌细胞p53 及其p53 通路 的下游基因 p21“”表达的关系。方法：所用细胞株分别为P53 基因无突变的肝癌细胞株HepGZ 和 BEL7404，P53 基因缺失的肝癌细胞株Hep3B，永生化正常肝细 ）他 L02。用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） fu单链构象多态性分析（single strand conformatlon polymorphism．SSCP）分析永生化正常肝细胞 L02的 p53 基因状 况。在用终极稀释滴定法确定H101滴度后t分别以不同的空斑 形成年．位／细胞（multofe of infection，MOI）感染不同 P53 基因型的细 胞株，培养 8 天后用 MTT法观察 H］of M细胞的杀伤作用。用 5 MOI的H101感染L02、HepGZ 和 HepGZ，并设不加病毒的对照 组；然后分别在感染后第24、36小时取样，用免疫组化染色观 察细胞株 p53、p21“”基因表达的变化。 结果：（l）L02 的p53 基因无突变。 2 浙江大学博士学位论文 （2 ） H101在MOI为 100、10、l、0．l、0．of 时对BEL7404细胞 株的杀伤率分别为 80．7％、2．5％、l．6％、2．5％、2．4％： H101在MOI为 100、10、l、0．l、0刀1 时对HepGZ 细胞 株的杀伤率分别为 98．3％、99．l％、98．9％、l．8％、2．1 ％；H101在MOI 为100、10、1、0．l、0刀］时对L02 细 胞株的杀伤率分别为 sl．9％、4．3％、3二％、3．5％、3．7 ％；H101在MOI为100、10、l、0．l、0．of 时对Hep3B 细胞株的杀伤率分别为99二％、99．4％、99二％、引J ％、28．8％。肝癌细胞株 Hep3B（p53基因缺失）在 H101为 0．IMOI以上时即可被显著杀伤：H：pGZ（p53基因野生型） 在 MOI为 1 时以上时才被显著杀伤；BEL7404（p53基因野 生型）和 L02 （p5基因野生型）在 MOI为 100 以上时才被 显著杀伤。 （3）在H101作用24、36’J’时后，HepGZ 和 L02 的实验组 p53、pZI””蛋白表达均为阳性，而对照组为阴性； Hep3B 实验组的 pZIW”蛋白表达在 H101感染后和对照组 一样始终为阴性。 结论：（1）L02 的 p53 基因为无突变的野生型。 （p ） 低浓度H101对肝癌细胞的选择性杀伤作用与 p53 基因突 变