关节软骨是一种具有特殊层状结构的结缔组织,主要由浅表层、中间层、深化层和钙化层组成。关节软骨没有血管、淋巴管以及神经分布,损伤后自我修复能力很差。组织工程目前已经发展成为一种有临床潜力的关节软骨缺损修复技术。组织工程技术主要是通过综合利用可降解支架、种子细胞和某些特定信号分子协同作用对关节软骨损伤实施修复。根据关节软骨的层状结构和各层的组成成分特点,本研究利用满足体内生物相容性要求的壳聚糖、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石等材料,通过低温成型技术组装含纳米纤维膜钙化层的层状仿生支架。首先利用共沉淀法在常温常压下合成了壳聚糖/纳米羟基磷石复合物。经X-射线衍射和扫描电镜表征得出,该法合成得到的复合物中纳米羟基磷石呈梭状,长度约200 nm,结晶良好,分散均匀,这些复合物可复溶于稀酸溶液,满足支架组装要求。同法获得的纳米羟基磷石纳米粒子具有相似的形貌和性质。在此基础上,将纳米羟基磷灰石、壳聚糖、丝素蛋白按设计配方制备成4种电纺液,经电纺获得各层组分呈梯度变化的一体化四层纳米纤维膜钙化层。扫描电镜观察结果显示,纳米纤维粗细均匀,纤维表面有纳米羟基磷灰石凸起物,而且凸起物随纳米羟基磷灰石在纤维中的含量增加明显增多。分别以壳聚糖/丝素蛋白复合物、所获得的纳米纤维膜和壳聚糖/纳米羟基磷石复合物组装含纳米纤维膜钙化层的四层结构仿生层状支架。红外光谱分析表明,壳聚糖/丝素蛋白复合物、壳聚糖/纳米羟基磷石复合物均为物理混合,无明显化学相互作用。扫描电镜观察得出,从仿软骨层到仿软骨下骨层,支架孔径呈梯度变化;除钙化层外,各层孔隙率较高;钙化层平均孔径小于3μm,孔隙率较低。该支架近似满足软骨细胞或成骨细胞生长对孔径和孔隙率的要求。以MC3T3细胞为种子细胞,与不同浓度的支架浸提液共培养,MTT法检测细胞活性。结果表明,细胞增殖正常,不同浓度浸提液对细胞均没有毒性。将MC3T3分别接种于支架的仿软骨层和仿软骨下骨层并进行培养,分别经7天、14天培养,扫描电镜观察指出,细胞伸出伪足,增殖正常,并合成分泌细胞基质。随培养时间延长,细胞数目增加,细胞基质的量也增加。以纳米纤维膜为钙化层,以壳聚糖、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石为支架材料组装的层状仿生支架在孔径、孔隙率、生物相容性等方面均满足细胞生长需要。该支架经后续应用转化研究将可能在软骨损伤修复方面有一定的临床应用价值。