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目的：RNA干扰技术是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默,具有高度特异性,已广泛应用于肿瘤治疗的研究。然而,以往研究报告中的shRNA表达载体都只能转录生成一种特异性的小干扰RNA,阻断单一基因的表达,很难对肿瘤这种多基因疾病起到治疗效果。我们构建出含有双启动子的shRNA表达载体,并选择在绝大多数肿瘤细胞中都有高表达的hTERT及Bcl-2基因[2,3]进行功能测试,考察这种双启动子shRNA表达载体的基因沉默效果及对肿瘤细胞增殖的影响。而且通过建立这种模式化工具载体,可以为今后RNA干扰技术实验研究的开展和深入奠定基础。方法：1.改造实验室常用的真核表达载体pcDNA3.1(+),切除CMV启动子及其转录终止序列,保留Ampr和Neor基因完整表达框以及原核复制起始点,插入PCR扩增人基因组DNA得到的两段U6启动子,构建出双启动子shRNA表达载体pdPRO。2.针对人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)与B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因序列,根据短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)设计原则,化学合成编码shRNA的DNA单链。将相应的DNA单链退火后分别连在两段U6启动子的下游,构建出靶向hTERT和Bcl-2基因的shRNA重组质粒pdPRO-TB。另外构建对照质粒pdPRO-T(靶向hTERT基因的shRNA重组质粒)及pdPRO-B(靶向Bcl-2基因的shRNA重组质粒),测序鉴定。3.实验分为与实验平行不加细胞的空白对照组、空脂质体组、阴性对照组(pdPRO组)、pdPRO-TB组、pdPRO-T组及pdPRO-B组。将各组质粒同时转染Hela细胞,每组6孔。MTT法检测细胞增殖活性,计算细胞增殖抑制率。结果：1.测序和酶切鉴定证实重组质粒pdPRO、pdPRO-TB、pdPRO-T及pdPRO-B均成功构建。2.各组质粒瞬时转染细胞48h后,与转染前正常生长的Hela细胞相比,pdPRO-TB组悬浮细胞明显增多,贴壁细胞减少,细胞生长减慢；pdPRO-T与pdPRO-B组也出现类似改变,但不如]pdPRO-TB组明显；阴性对照组细胞形态无改变,培养板底部基本被细胞贴满。3.MTT结果显示,时间因素和组别因素对细胞增殖抑制率均有影响(F值分别为287.107,391.590,P<0.01)；时间与组别因素间存在交互作用(F=41.592,P<0.01)。在24h、48h、72h,pdPRO-TB组、pdPRO-T组、pdPRO-B组的细胞增殖抑制率明显高于空脂质体组和阴性对照组(P<0.01),pdPRO-TB组抑制细胞增殖的效果最强,pdPRO-T组次之,pdPRO-B组抑制效果最弱；空脂质体组与阴性对照组之间的细胞增殖抑制率相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。转染24小时后小干扰RNA对Hela细胞增殖的抑制作用开始显现、但效果尚弱,48小时最明显,72小时抑制效果转弱。结论：ShRNA重组质粒pdPRO-TB可以抑制Hela细胞增殖,同时pdPRO-T及pdPRO-B对细胞增殖也有不同程度的抑制作用、但抑制效果次之,这说明靶向hTERT和Bcl-2基因的siRNA对肿瘤细胞增殖的抑制作用可能存在协同效应。同时,这种模式化工具载体的构建及转染实验表明该载体是新型的、高效可行的、并容易操作的工具载体,为多基因调控的肿瘤疾病治疗提供了新的思路,具有重要的科研价值和应用前景。