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禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的一种危害家禽的常见疾病,给家禽养殖业造成了严重的经济损失,甚至对人类生命安全健康产生了威胁,其中H7N9 AIV自2013年以来在全国多地区流行,自2017年开始使用疫苗后大大降低了 H7N9 AIV的流行率,因此检测免疫后产生的血清抗体水平以评估疫苗株的免疫效力至关重要,可为进一步预防H7N9 AIV提供参考依据。本研究旨在利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达具有反应活性的AIV N9蛋白作为包被抗原建立一种检测血清中N9抗体水平的阻断ELISA方法,对于评估当前H7N9-Re3疫苗株的免疫效力及对其它N9亚型AIV感染的分布状况具有重要的应用价值。1 N9亚型禽流感病毒NA蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定将DK/HuN/S11670/2015（H11N9）的NA基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBac HT A,构建重组转移载体pFastBac HT A-N9,经PCR和测序鉴定后转化至DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选提取重组杆粒rBacmid-N9经PCR及测序鉴定正确后,转染至sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染sf21细胞后,利用间接免疫荧光、Western blot和间接ELISA方法鉴定重组N9蛋白的反应活性。结果显示表达的重组N9蛋白可以与鼠源N9蛋白单克隆抗体发生特异性反应,以表达的重组N9蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分N9蛋白抗体阳性血清和非N9蛋白抗体血清。以上结果表明重组N9蛋白具有良好的反应活性,为建立阻断ELISA血清N9抗体检测方法奠定了基础。2 AIV N9蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立以重组杆状病毒感染昆虫细胞的细胞膜总蛋白作为包被抗原,确定了阻断ELISA方法最佳工作条件。通过棋盘滴定法确定了最佳蛋白包被浓度为1:5000（5.75μg/mL）,鼠源N9蛋白单克隆抗体最佳浓度为1:30000（0.92μg/mL）。以最佳抗原包被浓度和最佳鼠源N9蛋白单克隆抗体最佳浓度为基础逐步改变单因素进一步确定其余最佳反应条件:最佳包被条件为4℃过夜12 h;最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃孵育1 h;待检血清最佳稀释度和孵育时间分别为1:20和37℃孵育1.5 h;单克隆抗体最佳孵育时间为37℃孵育1h;HRP标记的羊抗鼠IgG（H+L）二抗最佳稀释度和孵育时间为1:500037℃作用1 h;最佳显色时间为10min。在最佳工作条件下利用阻断ELISA方法对193份阴性血清检测计算抑制率,计算其中抑制率大于0的140份血清平均抑制率及标准偏差后,根据临界值公式求得临界值,得出阴性血清的平均抑制率为8.67%,标准偏差为4.06%,阴性临界值为16.79%,阳性临界值为20.85%,16.79%～20.85%之间判为疑似。特异性试验结果显示阻断ELISA方法只能特异性识别N9亚型AIV血清,具有较好的特异性。用SPF鸡血清倍比稀释H11N9、H1N9、H7N9-Re2和H7N9-Re3阳性血清,对HI效价20～27的稀释血清进行阻断ELISA方法检测,结果显示4份N9亚型阳性血清在HI效价大于等于24时均判为阳性,表明阻断ELISA方法具有较好的敏感性。选择32份实验室保存背景清楚的H7N9、H1N9和H11N9亚型阳性鸡血清进行阻断ELISA方法检测,结果显示32份血清经检测均判为阳性,表明阻断ELISA方法具有较好的广谱性。选择3份N9亚型阳性血清和2份非N9亚型血清进行重复性试验,结果显示板内及板间变异系数均低于12%,表明阻断ELISA方法具有良好的重复性。对养殖场接种H7N9-Re3疫苗株的478份鸡血清、378份鸭血清和40份鹅血清进行HI检测后进行阻断ELISA方法检测,H7N9-Re3血清敏感性试验结果显示当HI效价小于23时,经阻断ELISA方法检测,血清判为阴性,因此以HI效价等于23为检测极限临界点,临床样品检测结果显示:HI效价等于20时鸡血清阴性符合率为92.31%,HI效价大于等于23时鸡血清阳性符合率为98.47%,总符合率为97.91%;HI效价等于20时鸭血清阴性符合率为91.50%,HI效价大于等于23时鸭血清阳性符合率为94.86%,总符合率为93.29%;HI效价等于20时鹅血清阴性符合率为90.00%,HI效价大于等于23时鹅血清阳性符合率为92.00%,总符合率为91.43%,相对于鸭和鹅来说,鸡的符合率更高,说明该方法更适用于评估鸡血清N9抗体水平。综上所述,本研究建立的阻断ELISA抗体检测方法可以用于初步评估养殖场H7N9-Re3疫苗株免疫效力。