研究背景儿童不是成人的缩小,而是处于不断发育过程中,他们有着独特的生理、心理和社会学特征,新生儿作为儿童中的一个特殊群体,其组织器官(如肝脏、肾脏等重要药物代谢排泄器官)尚未发育成熟,各种酶系统发育不健全,其对药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程及毒理学反应均不同于其他年龄段儿童,更不同于成人。新生儿的体内药物处置过程与其他年龄段儿童存在差异,同时存在显著的群体内差异。在缺乏大量的儿童尤其是使用于新生儿治疗药物数据的前提下,如何进行安全有效的个体化药物治疗是新生儿疾病诊治中的一个重要课题。由于传统伦理因素的制约,血药浓度采样点的限制,传统药动学无法对新生儿的药物处置特征进行研究,造成临床大量新生儿药物治疗数据的缺乏,患儿承担着超说明书用药带来的巨大风险。据国外报道,80%-97%的新生儿至少接受过一次超说明书用药。与国外相比,目前国内儿童的临床用药研究资料更为缺乏,缺少有效的研究方法是导致该领域临床试验数据缺失的重要原因之一。近年来在临床药物动力学基础上发展起来的群体药代动力学(population pharmacokinetics, PPK)已在发达国家中开始应用于临床治疗学领域的研究,该方法能利用稀疏不均的数据进行统计分析,且对每名患者采样次数要求低,同时又能将新生儿生长发育中胎龄、体重等重要数据作为药代动力学的研究资料,尤其适合在新生儿中应用。由于细菌感染在新生儿特别是早产儿中发生率较高,哌拉西林/他唑巴坦是目前临床治疗新生儿中重度感染的常用药物,然而该药尚无2个月内小儿的药物研究资料,因此本课题通过考察哌拉西林/他唑巴坦在新生儿特殊群体中的药代动力学特点,探寻开展新生儿临床用药研究的方法。由于此次PPK研究系在新生儿中进行,存在样本量大,取血量少等客观情况,因此对血药浓度测定的要求是快速、准确、特异性高、取血量少。为此我们利用高效液相色谱-串联质谱技术(high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, HPLC-M S/MS)建立了哌拉西林/他唑巴坦的浓度检测方法,并对该方法进行了方法学的验证。在获得PPK参数后,将结合哌拉西林/他唑巴坦最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)建立、优化给药方案,最终达到提高抗感染治疗疗效以及安全性的目的。本课题研究内容包括以下二部分：第一部分哌拉西林/他唑巴坦血药浓度检测方法的建立及验证目的：欧洲药品局出台的新生儿临床药物研究的指南中,规定临床研究相关的血液丢失量,每个新生儿在四周内不超过其血容量的3%,每次不超过其血容量的1%。按照90mL/kg体重估算,一名体重2500g的新生儿血容量为225mL,每次血样采集量不超过1%,即为2.25mL。低体重新生儿每次可接受的采血量少于2.25mL。目前文献报道的检测哌拉西林和他唑巴坦血药浓度的高效液相色谱法(HPLC)或高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)要求较大的样本量,适用于成人血药浓度的测定。因此,亟需建立适合测定少量血样,灵敏且特异性高的测定哌拉西林和他唑巴坦血药浓度的方法。由于游离浓度较总浓度更能反映抗生素的临床疗效,建立的测定方法必须还能测定游离药物浓度。方法：匹莫齐特作内标,用特丁基甲醚从血浆样品中萃取出哌拉西林和他唑巴坦,通过高效液相色谱分离两药,串联质谱仪分别测量和计算两药的含量,即为血浆样品中哌拉西林总浓度和他唑巴坦总浓度。血浆样品通过超滤离心后得到的超滤液用同样的方法处理,即得到血浆样品中哌拉西林游离浓度和他唑巴坦游离浓度。结果：建立的方法符合美国食品药品监督管理局(FDA)发布的生物样品测定方法验证指南中的各项标准。检测哌拉西林血浆总浓度和游离浓度的标准曲线线性范围是100-10000ng/mL,检测他唑巴坦血浆总浓度和游离浓度的标准曲线线性范围是30-3000ng/mL。哌拉西林血浆总浓度检测的批内差异小于10%,批间差异小于7.3%。他唑巴坦血浆总浓度的批内差异小于5.3%,批间差异小于5%。哌拉西林游离浓度检测的批内差异小于14.2%,批间差异小于9.9%。他唑巴坦血浆游离浓度的批内差异小于13.0%,批间差异小于9.5%。所有批次的准确性都在标准可接受范围内(85-115%)。哌拉西林总浓度和游离浓度的最低定量限均为100ng/mL,他唑巴坦总浓度和游离浓度的最低定量限均为30ng/mL。测定血浆总浓度需要50μL血浆。测定血浆游离浓度需要50gL超滤液。结论：建立的方法符合FDA对于测定方法学的验证标准,可用于测定新生儿和婴儿的少量血浆样品中哌拉西林和他唑巴坦的血浆总浓度和游离浓度。第二部分哌拉西林／他唑巴坦在新生儿群体药动学的建立、验证与剂量调整群体药代动力学(PPK)是药物动力学研究领域中近几十年发展出的一个新分支。PPK是PK群体分析法,它将经典的PK模型与群体统计学模型相结合,研究某一群体药代动力学参数的分布特征,定量考察患者群体中影响血药浓度的决定因素,较准确地估算各参数。传统的PK模型通常取样点较多,而PPK能够利用稀疏、不均衡的数据。群体药动学的研究方法主要有参数法和非参数法,目前国内外应用最为广泛的是非线性混合效应模型法(nonlinear mixed effect model, NONMEM)。NONMEM法所需样本量低,即使只有一个治疗药物监测(therapeutic drug monitoring, TDM)数据也可得出相关性很好的个体PPK参数,对婴幼儿的用药研究具有重大意义。目的：评价哌拉西林/他唑巴坦多次给药在新生儿及小婴儿体内的药动学过程,为临床安全有效的药物治疗提供依据。方法：本课题第一阶段对我院2011年1月至2011年5月在新生儿重症监护室及新生儿普通病房的出生后日龄小于61天住院患儿,按课题制定的入选以及排除标准进行筛选。符合条件的患儿家长将被专业人员充分告知,签署知情同意书后入组并给予研究编号。共纳入新生儿46例,小婴儿25例,根据患儿的胎龄(postmenstrual age, PMA)及产后日龄(postnatal age, PNA)分为A、B、C、D四组,每次给药剂量均为44.44/5.56mg/kg体重,给药途径均为静脉缓慢推注,疗程均为5天,A、B两组给药间隔为12h,C、D两组给药间隔为8h。入组患儿将进行一系列基础检查,并详细记录每天的给药时间、采血时间以及合并用药情况,同时密切关注其可能发生的任何药物不良反应(ADR)。第一阶段共收集71名患儿207例血样,采用NONMEM法分别建立了哌拉西林、他唑巴坦二室模型,研究患儿的性别、胎龄、年龄、体重、体表面积、肝、肾功能(CLcr、Scr值)及合并用药等固定效应对该药药代动力学参数的影响,同时考察患者个体间、个体内药物动力学参数的差异,筛选出对药物动力学参数有影响的固定效应。分别采用Bootstrap、Visual predictive check (VPC)、NPDE法对模型进行内部验证。在此基础上,在本课题的第二阶段对26名患儿哌拉西林-他唑巴坦进行剂量调整,确立个体化给药方案,同时对先前建立的模型进行验证。并且,进行药效学评价,同时根据筛选出的2个最相关的协变量分类进行亚群的模拟,为临床提供给药方案。结果：选取了目标函数值更低、在抗菌药物药动学研究中应用更为广泛的二房室模型。哌拉西林、他唑巴坦目标函数值分别为1048.746和144.293。哌拉西林药动学参数如下所示,用群体值±标准误表示分别为：CL(0.369±0.014)L/h、V1(0.742±0.069) L、Q (1.11±0.53) L/h、V2(0.269±0.062) L。他唑巴坦药动学参数如下所示,用群体值±标准误表示分别为：CL (0.414±0.014) L/h、V1(0.803±0.080) L, Q (2.2±0.62) L/h、V2(0.391±0.069) L。与基础模型相比,二室最终模型药代参数的个体间变异明显缩小(哌拉西林二房室清除率个体间变异由基础模型的83.4%降至最终模型的18.0%,中央室分布体积个体间变异由基础模型的50.2%降至最终模型的20.8%；他唑巴坦二房室清除率个体间变异由基础模型的84.7%降至最终模型的16.1%,中央室分布体积个体间变异由基础模型的33.5%降至最终模型的20.3%),模型内部验证(Bootstrap法、VPC法、NPDE法)表明,该模型具有较好的稳定性和预测准确性。根据第一阶段建立的哌拉西林的药动学模型,对26名患儿哌拉西林-他唑巴坦进行剂量调整,确立个体化给药方案,同时对先前建立的模型进行验证。结果表明,群体预测值与实测值较为接近,模型具有较好的预测能力(γ=0.884),进一步验证了第一阶段构建的模型的预测准确性。对哌拉西林/他唑巴坦进行药效学评价,提示44.44/5.56mg/kg/dose,每12小时或每8小时一次的给药方案,约67%的新生儿和小婴儿在给药间隔的一半时游离哌拉西林的血药浓度达4mg/L(大肠埃希菌MIC值)以上。这种给药方案可能不够合理,为了达到更好的控制感染和临床疗效,有必要提高剂量或增加给药频率,进行个体化给药。结论：采用NONMEM法建立了哌拉西林的(哌拉西林/他唑巴坦,哌拉西林为主药,他唑巴坦增强哌拉西林药效)的二房室模型,结果表明该模型具有较好的稳定性和预测准确性,为临床安全有效的药物治疗提供依据。