PD-1（programmed death 1）是一个含有免疫受体酪氨酸抑制性基序（ITIM）免疫球蛋白超家族成员，与CD28、CTLA-4和ICOS分子同属于CD28超家族，与同为负调节共刺激分子CTLA-4的胞外区有24％同源，它为一分子量为55KD的Ⅰ型跨膜蛋白，主要以单体形式表达于活化的CD4⁺T和CD8⁺T细胞及B细胞，其配体PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC）则广泛地表达于淋巴组织和非淋巴组织各种细胞。体外实验发现：PD-1与PD-L1或PD-L2结合后，能抑制已经活化的T细胞增殖及产生细胞因子，特别是抑制效应性CD8⁺T细胞的功能。在抗原刺激时，PD-1-PD-L1途径能拮抗较强烈的CD28-B7信号，揭示了PD-1-PD-L1途径在T细胞应答中的负调节作用。PD-L1和PD-L2在非淋巴组织的表达，提示它们可以下调自身反应性T、B细胞在外周组织中的应答。Pd-1^-/-的C57BL/C小鼠可发生风湿、肾小球肾炎、扩张性心肌病及SLE等多种自身免疫性疾病，表明缺乏PD-1时，外周的自身反应性T细胞有自发活化的倾向。研究证实，增强PD-1的信号可以下调已活化的T、B细胞在外周组织中的应答，在维持外周T、B细胞耐受中发挥重要的作用。 因为PD-1具有负调节信号方面的作用，是影响效应性和记忆性T细胞功能的重要共刺激信号通路。所以它很快成为免疫学研究的一大热点分子。为了深入探讨PD-1在调节外周耐受中的机制及其它生物学功能，制备可溶性分子PD-1-Fc和PD-L1-Fc（B7-H1-Fc）蛋白就具有重要意义：一方面，可溶性的PD-L1-Fc结合受体后，在体内可增强PD-1对T细胞负调节作用，当条件成熟时，可被开发成一种免疫抑制剂用于器官移植；另一方面，获得的可溶性PD一1一Fc蛋白，为我们进一步探讨PD一1在免疫自稳调节中的地位及其在动力学与信号转导方面的机制奠定了坚实的基础。本研究主要进行了以下三部分的工作: 1.人PD一1全长cDNA的克隆、真核表达载体的构建 （l）采用PCR技术，从来自活化正常人T细胞的cDNA文库p队D.cAD扩增出编码人PD一1全长288aa的cDNA序列，装入克隆载体后，经Amp抗J胜筛选获得阳性重组子后，经测序证实同公布的PD一IcDNA序列一致，编码氨基酸完全一致。 （2）将全长PD一1的eDNA片段从克隆载体上用Hindin和Xbal切下来，装入Hindlll和Xbal线性化的真核表达载体penNA3 .1（+）中，酶切鉴定出阳性重组子，为从细胞水平研究PD一1的功能奠定了基础。 2.人PD一1一F。及B7一Hl一F。的真核表达载体的构建。 利用基因工程技术将PD一1膜外区与hlgGIFc一起装入真核表达载体peDNA3 .1（+）中，而将B7一Hl膜外区与hlgGIFc一起装入真核表达载体pcl一neo中:经筛选序列测定，证实得到了PD一1和B7一Hl的可溶性表达重组载体，为进一步得到其可溶性蛋白打下了基础。 3.人PD一1一Fc和B7一Hl一Fc蛋白的表达，纯化和鉴定。 （l）用脂质体法转染哺乳动物细胞CHO，夹心EUSA法，证实培养上清中有融合蛋白的表达。 （2）蛋白A亲和层析法纯化融合蛋白PD一l一Fe和 B7一Hl一Fe，用SDS一PAGE初步确定它们单体的分子量与预测的基本相符，分别为42.86KD和sl.76KD。 （3）用化学发光免疫印迹法进一步证实培养上清中有PD一1一Fc和B7一Hl一Fc蛋白的表达，且具有免疫学活性。