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有研究表明,心血管病死亡率居于各种疾病的首位,其中又以缺血性心脏病死亡为主要,尽早恢复血供是防治心脏缺血死亡的最有效措施。目前,心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤仍然是急性心肌梗死临床治疗中面临的难题,研究心肌I/R损伤发生机制,将有助于我们为临床防治心肌缺血再灌注损伤提供理论和实验依据。研究表明牛磺酸(Taurine,Tau)具有抗氧化及调节胞内钙稳态等多种功能,对心肌I/R损伤、心肌梗死、心力衰竭等缺血性心脏病有很好的防治作用。p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)作为促凋亡作用最强的BH3-only蛋白质家族,被认为是缺血性心脏病防治的新靶点。缺血缺氧等多种刺激作用于内质网,使内质网内未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多,引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)是内质网应激经典标志物,并可引起细胞凋亡。本实验以大鼠心肌细胞H9C2为对象,用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模拟I/R损伤,观察PUMA、CHOP过表达对心肌细胞H/R凋亡的影响,探讨Tau保护I/R心肌细胞凋亡的途经及其分子机制,为拓宽Tau在I/R损伤防治中的应用提供新的实验依据。目的:1.观察PUMA、CHOP对心肌细胞缺氧/复氧凋亡的影响,探讨PUMA、CHOP在牛磺酸保护缺血/再灌注心肌细胞免遭损伤中的作用。2.探讨牛磺酸对心肌细胞缺血/再灌注损伤的保护作用与内质网应激之间的关系及其作用机制。方法:1.采用大鼠心肌细胞株H9C2细胞作为研究对象,采用缺氧3h,分别复氧2h、4h、6h、12h建立细胞缺氧/复氧模型。探讨缺氧/复氧不同时间对心肌细胞凋亡及PUMA、AP-1、CHOP、GRP78、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白和mRNA表达的影响。2.用不同浓度Tau(0 mM,20 m M,40 m M,80 m M,120 m M,160 mM)分别作用H9C2心肌细胞1h后,对其建立缺氧/复氧模型,探讨牛磺酸对心肌细胞H9C2缺氧/复氧的影响。3.研究当PUMA、CHOP过表达时牛磺酸对心肌细胞H9C2缺氧/复氧保护作用的影响。4.观察用特异性si RNA沉默PUMA、CHOP的表达时牛磺酸对心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的分子机制。结果:1.Western Blot结果显示,大鼠心肌细胞H9C2在缺氧3h、复氧6h时PUMA、CHOP、Caspase-3、AP-1、Bax等蛋白及mRNA表达最高,而GRP78随着时间的推移不断升高。此外,流式细胞仪检测数据显示,凋亡率高低具有时间依赖性。2.Western Blot结果显示,在H9C2细胞中,浓度为80 mM的Tau能够显著降低PUMA、CHOP、Caspase-3、Bax蛋白表达(P<0.01)。与对照组比较,在缺氧3h、复氧6h时,PUMA、CHOP、Bax、GRP78、Caspase-3的表达显著降低(P<0.01),Bcl-2表达升高。Tau浓度为80mM时Caspase-3活性最低(P<0.05)。3.转染质粒p-EGFP-PUMA并建立模型发现,Caspase-3和Bax的蛋白表达升高(P<0.05),而GRP78、AP-1、CHOP的表达没有明显变化(P>0.05)。Tau(80 mM)联合处理可以降低此效应。RT-qPCR结果显示,p-EGFP-PUMA组中Caspase-3和Bax的mRNA的表达明显升高(P<0.01),牛磺酸(80 mM)联合处理阻碍PUMA高表达的作用。Caspase-3活性检测结果显示p-EGFP-PUMA组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。4.转染PUMA-siRNA并建立模型发现,Caspase-3和Bax的蛋白表达降低(P<0.05),Tau(80 m M)联合处理使此效应更为显著。PUMA-siRNA组的Caspase-3和Bax mRNA的表达显著降低(P<0.01)。Caspase-3活性检测结果显示PUMA-siRNA组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。5.体外介导质粒p-EGFP-CHOP后,Caspase-3、PUMA、AP-1、Bax的蛋白表达升高(P<0.05),而GRP78的表达没有发生明显变化(P>0.05)。Tau(80 mM)联合处理可以降低此效应。RT-qPCR结果显示,p-EGFP-CHOP组的Caspase-3、PUMA、AP-1、Bax m RNA的表达显著升高(P<0.01),Tau(80 mM)联合处理阻碍CHOP高表达的作用。Caspase-3活性检测结果显示,p-EGFP-CHOP组与对照组的Caspase-3活性有统计学差异(P<0.05)。6.转染CHOP-siRNA后,Caspase-3、PUMA、AP-1、Bax的蛋白表达下降(P<0.05),Tau(80 mM)联合处理使此效应更为显著(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,PUMA-siRNA组的Caspase-3、PUMA、AP-1、Bax mRNA的表达显著降低(P<0.01)。Caspase-3活性检测结果显示CHOP-siRNA组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:1.大鼠心肌细胞株H9C2进行缺氧/复氧后,可引发细胞凋亡,而经过Tau预处理1h后凋亡率有显著性降低,起到抗凋亡作用。2.Tau能抑制大鼠心肌细胞株H9C2细胞缺氧/复氧引起的凋亡,其作用机制是通过降低CHOP蛋白表达,减轻内质网应激造成的损伤,进而使PUMA表达降低,Caspase-3活性下降,抑制线粒体凋亡通路。因此,CHOP有望成为心肌缺血/再灌注损伤防治的新靶点。