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随着人们对优质猪肉要求的提升,猪肉质性状在猪的育种目标中显得日益重要。猪TPM3基因是本实验室应用RT-PCR-DHPLC技术在蓝塘、大白和杜洛克三个猪品种中筛选出的差异表达基因,尤其在背长肌中差异表达明显。TM与TNN作为复合体协同影响ATP体系和肌肉收缩,从而影响肌纤维的长度,进而影响肉质风味。本研究从TM生理生化功能出发,应用侯选基因法对在猪肉质方面存在差异表达的基因——猪TPM3基因进行研究。然后通过比较基因组学、RACE技术、RH定位、.克隆测序、SNP查找等方法研究猪TPM3基因。目的是从mRNA水平提供依据验证该基因是否为肉质性状的侯选基因,为DNA辅助标记选择提供依据。主要研究结果如下:
(1)根据NCBI登录的猪TPMs基因的部分序列,设计基因特异性引物,应用RACE方法,快速获得猪TPMs基因5’、3’末端cDNA序列。拼接获得猪TPMs基因全长1238bp的cDNA序列(登录号:DQ266103)。分析可知:猪TPMs基因mRNA序列包括259bp的5UTR,747bp的ORF(位于260bp~1007bp区域),232bp的3’UTR。预测该基因编码248个氨基酸(登录号:ABB54390)。
(2)应用生物信息学对猪TPMs基因编码的氨基酸序列进行分析发现:该肽链具有TM家族典型的保守区。不同物种TPMs基因核苷酸同源性比对分析,发现猪与黑猩猩同源性最高,为98.67%。不同物种TPMs基因编码的氨基酸序列同源性比对分析,与人同源性最高,为99.2%。通过疏水性和信号肽预测发现在CDS的131.138氨基酸处有一个疏水区域,第6个氨基酸处有一个最大的疏水性位点,分值为1.278。跨膜区域分析结果显示该肽链没有跨膜区域。应用神经网络算法和隐马氏模型分析该肽链无信号肽,这和该基因具有组织和肌丝特异性表达相符。
(3)以大白猪和蓝塘的cDNA为材料,利用PCR产物直接测序筛选可能与猪肉质性状相关的SNP。在TPMs基因的cDNA序列内共检测到7个SNP,其中在5UTR检测到1个SNP,在ORF检测到6个SNPs:包括3个单碱基转换,2个单碱基颠换,2个单碱基缺失。其中T-440(C-G)、T-452(A-G)、T-565(A-G)、T-650(T-C)、T-658(T-~)处的变异引起氨基酸的改变,且氨基酸性质有很大变化。
(4)利用IMpRH¨8个猪和仓鼠辐射杂种细胞系平板将猪TPMs基因定位在SSC4上,与最近的连锁标记SW512相距53cR,LOD值达到7.48,符合定位标准。有研究表明SW512标记与眼肌面积、背膘厚、骨肉比、日增重等产肉与肉质性状有关。进一步推测猪TPM3基因可能是影响猪产肉与肉质性状的侯选基因。