石墨烯（RGO），即单层石墨层片，仅有一个碳原子厚度，是由sp2杂化碳原子紧密排列而成的蜂窝状晶体结构。石墨烯具有高的比表面积、突出的导热性能、力学性能及非凡的电子传递性能等一系列优异的性质，因此被广泛的应用于纳米电子器件、传感器、药物载体、超级电容器以及能量存储等领域。目的：将石墨烯与其他纳米材料相结合，开发出一种导电性高、生物兼容性好、对酶亲和力强的新型石墨烯纳米复合材料，利用葡萄糖氧化酶（GOD）为模型酶，探索石墨烯在生物传感器中的应用。在此基础上，通过电沉积法，将石墨烯与纳米金（AuNPs）相结合，高效固定乙酰胆碱酯酶（AChE），构建灵敏度高、稳定性好、电化学响应快和重现性好的农药生物传感器。为农药的快速检测提供灵敏的科学方法，为同类其他生物传感器的构建提供理论依据。方法：第一部分：石墨烯的制备、表征以及在葡萄糖生物传感器中的应用第一步：采用Hummers和offeman方法制备氧化石墨烯（GO），并以葡萄糖作为还原剂由氧化石墨烯制备石墨烯。第二步：采用X-射线衍射法（XRD）和紫外-可见分光光度法对氧化石墨烯和石墨烯进行表征。第三步：在电沉积制备普鲁士蓝-壳聚糖（PB-CS）膜修饰金电极的基础上，引入新型纳米材料石墨烯，以葡萄糖氧化酶为模型酶，构建基于RGO/PB-CS纳米复合材料的葡萄糖生物传感器。采用循环伏安法（CV）和时间-电流（i-t）曲线法研究了传感器的电化学特性和石墨烯、普鲁士蓝对传感器灵敏度的影响，探讨了该传感器的抗干扰性和实际应用。第二部分：基于普鲁士蓝/石墨烯-纳米金-β-环糊精杂交膜的农药生物传感器研究。第一步：采用恒电位法在电极表面组装石墨烯-纳米金-β-环糊精杂交膜(RGO-AuNPs-β-CD)。第二步：采用CV法在电极表面组装PB-CS膜。第三步：以生物兼容性良好的壳聚糖为载体，高效固定乙酰胆碱酯酶(AChE)。实验中采用酶抑制法检测有机磷农药和氨基甲酸酯类农药。有机磷农药和氨基甲酸酯类农药能够抑制AChE的活性，使得电极表面AChE对氯化乙酰硫代胆碱（ATCl）的催化能力下降，产生的硫代胆碱（TCh）减少，电信号下降，据此实现了对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的高灵敏检测。采用扫描电镜技术（SEM）和CV法对电极表面进行表征，并采用i-t曲线法研究传感器对ATCl的电流响应。探索了抑制时间对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药检测的影响，并考察了传感器的再生性、稳定性、重现性以及准确性。结果：1石墨烯的制备、表征以及在葡萄糖生物传感器中的应用1.1通过本次实验制备的石墨烯不经任何处理，能够稳定存在，可直接应用于传感器的构建。由XRD图分析可知，在氧化还原过程中石墨粉的晶型结构被破坏，晶体完整度下降，片层缩小，最终合成石墨烯。而紫外光谱扫描图表明，氧化石墨烯表面的含氧官能团逐渐被还原，л-л共轭体系逐渐被修复，再一次证明了石墨烯的成功制备。通过CV法对不同修饰电极表面的导电性能进行表征，结果表明构建的电极响应界面具有良好的导电性能。1.2实验中采用i-t曲线法优化出该传感器的最佳工作体系：工作电位为0.0V，测试底液的pH值为6.5，葡萄糖氧化酶浓度为10.0mg mL-1，石墨烯用量为5μL。在最佳条件下，此传感器的催化电流在葡糖糖浓度0.01~1.05mM范围内成线性（相关系数为0.9999），具有较高的灵敏度65.3μAmM-1cm-2、较低的检测限6.00μM和较小的表观米氏常数1.43mM。此外，该传感器也表现出了响应快和选择性高的特点，可用于糖尿病人血糖的测定。2基于普鲁士蓝/石墨烯-纳米金-β-环糊精杂交膜的农药生物传感器研究2.1实验中优化了RGO-AuNPs-β-CD膜在电极表面组装的最佳条件。氯金酸、β-环糊精和氧化石墨烯的浓度分别为0.01%、0.025%和2.00mgmL-1，工作电位为–1.4V，沉积时间为720s。2.2实验中运用i-t曲线法优化出该传感器的最佳工作体系：乙酰胆碱酯酶浓度为0.5mg mL-1，应用电势为0.2V，测试底液pH值为6.5。2.3在最佳工作条件下，利用i-t曲线法获得的此传感器的催化电流与ATCl浓度分别在1.50~269.0μM和344.0~2219.0μM范围内成线性（相关系数分别为0.9992和0.9942），灵敏度分别为205和134μAmM-1cm-2。表明石墨烯和纳米金的协同作用有效提高了AChE对ATCl的催化作用，增强了复合材料电极对其水解产物硫代胆碱的响应信号。2.4实验采用示差脉冲伏安（DPV）法测定马拉硫磷和西维因的线性范围分别为8.00~2.00×103pg mL-1和4.30~1.00×103pg mL-1。2.5PB的加入，使该生物传感器能够在低电位下氧化氯化乙酰硫代胆碱的水解产物硫代胆碱，不仅提高了该传感器的灵敏度，同时也提高了该传感器的选择性。该传感器在4℃下储存28天，酶能保持92%的初始活性。2.6以碘解磷定为解毒剂，考察了乙酰胆碱酯酶的再生性，结果表明，经过一定浓度的马拉硫磷抑制后的乙酰胆碱酯酶在5.00mM碘解磷定中浸泡15分钟后，活性能够恢复94.8%。2.7样品回收率检测中，采用标准加入法，分别检测蔬菜中马拉硫磷和西维因的含量，结果表明二者的回收率分别在92.8%~106.7%和90.3%~101.5%之间，说明该方法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药具有较高的准确性。结论：本研究中首先采用化学还原法制备新型纳米材料石墨烯，并以葡萄糖氧化酶为模型酶，研究其在葡萄糖生物传感器中的应用，研究表明将石墨烯与普鲁士蓝-壳聚糖相结合，有效的促进了电极表面与分析底物之间的电子转移，改善了该传感器的工作性能。通过电化学沉积技术制备PB-CS/RGO-AuNPs-β-CD复合膜，制得新型乙酰胆碱酯酶生物传感器。石墨烯和纳米金的协同作用，有效提高了AChE对ATCl的催化作用，增强了复合材料电极对其水解产物硫代胆碱的响应信号。而PB的引入，不仅提高了这两种生物传感器的灵敏度，而且使得这两种传感器具有较低的工作电位（0.0V和0.2V），提高了传感器的选择性。乙酰胆碱酯酶传感器在实际样品检测中准确度高，并且其制备过程简单、成本低，具有潜在的应用价值。