论文部分内容阅读
目的 支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia ,BPD)是早产儿常见的慢性肺部疾病,BPD的发生与机械通气及长期吸入高浓度氧密切相关。CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα, C/EBPα)在肺发育及成熟等过程中作为关键转录因子发挥重要作用。本研究首先利用早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar typeⅡEpithelial Cell,AECⅡ),探讨高氧暴露对C/EBPα、肺泡表面活性蛋白 A(SP-A)、SP-B、SP-C、SP-D 表达及细胞增殖的影响;同时利用人AECⅡ细胞株,研究过表达C/EBPα对高氧暴露后AECⅡ增殖、凋亡及SP-C的影响,明确C/EBPα在高氧肺损伤中的作用。 方法 SD雌雄大鼠交配,雌鼠孕20 d-21 d时腹腔注射麻醉药后,剖宫取出胎鼠,分离纯化AEC Ⅱ,进行原代培养。利用95% O2构建高氧损伤AECⅡ细胞模型作为高氧组后续实验。将细胞随机分为空气对照组和高氧组。两组细胞分别在培养的24 h、48 h及72 h进行收集。使用倒置相差显微镜观察各组细胞的形态变化,实时荧光定量 PCR(Q-PCR)及 Western blot 法分别检测 AECⅡ细胞中C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C 及 SP-D mRNA及蛋白表达,采用 Cell Counting Kit-8(CCK-8 )检测 AECⅡ细胞增殖。利用人 AECⅡ细胞株,采用Lipofectamine2000脂质体介导法对AECⅡ细胞进行pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒及pcDNA3.1(+)-空质粒瞬时转染,将细胞随机分为空气组、空气组+pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒组、空气组+pcDNA3.1(+)-空质粒组、高氧组、高氧+pcDNA3.1(+)-C/EBPα 质粒组、高氧+ pcDNA3.1(+)-空质粒组,采用 Q-PCR 及Western blot检测C/EBPα和SP-C mRNA及蛋白表达,CCK-8检测各组细胞增殖, PI 染色法流式细胞仪检测细胞周期分布, Anne xin V/PI 双染流式细胞仪检测AECⅡ细胞凋亡。 结果 (1)空气组AEC Ⅱ细胞随着培养时间的延长,细胞生长状态良好,形态基本正常,未见明显漂浮的死细胞,C/EBPα表达水平逐渐降低,SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及AEC Ⅱ细胞增殖情况逐渐升高;而高氧组AEC Ⅱ细胞形态发生改变,逐渐变为不规则性状,且漂浮的死细胞逐渐增多,C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及增殖情况在培养48 h达到高峰;且在48 h时,高氧组AECⅡ细胞中C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D表达水平及增殖情况明显高于空气组。高氧组AECⅡ细胞C/E BPα表达情况与肺泡表面活性蛋白及AECⅡ增殖情况呈正相关。 ( 2 ) 待 AEC Ⅱ 细 胞 培 养 至 融 合 率 达 到 50% 以 上 后 进 行pcDNA3.1(+)-C/EBPα转染,转染后再次培养48 h,转染组C/EBPα mRNA及蛋白表达水平表达较其它组显著升高(P<0.05)。 (3)与空气组相比,高氧组和高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组细胞增殖、SP-C mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞周期G1期细胞比例增加,S期和G2期细胞明显下降,细胞凋亡率增加(P<0.05)。高氧+pcDNA3.1(+)-C/EBPα组细胞增殖、SP-C mRNA及蛋白表达水平较高氧组、高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组显著升高,细胞周期G1期细胞比例降低,S期和G2期细胞增加,细胞凋亡率降低(P<0.05)。与空气组和空气组+ pcDNA3.1(+)-空质粒组相比,在空气组+pcDNA3.1(+)-C/EBPα质粒组的AECⅡ细胞增殖、凋亡和SP-C表达没有显著的差异。 结论 (1)短期暴露于高氧状态下,C/EBPα可使肺泡表面活性蛋白分泌增加,参与机体的保护性调节作用,但随高氧暴露时间的延长,将丧失代偿保护作用。 (2)C/EBPα过表达可促进高氧暴露后AECⅡ细胞SP-C表达,促进增殖,抑制凋亡,且使S期和G2期细胞明显增加,提示给予过表达C/EBPα可能逆转高氧细胞损伤过程,起到保护作用。