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胰腺癌是恶性程度极高的一种消化系统肿瘤,致死率几乎为100%。其不易发现且具有较高的侵袭性和转移率,并且对常规的放化疗均不敏感。因此,胰腺癌患者的预后较差,5年存活率低于10%,中位生存时间仅为3-6个月,根治性切除加辅助治疗也仅能延缓生存期至23个月。自噬是真核生物中普遍存在高度保守的自我消化过程,其通过溶酶体途径降解自身胞浆蛋白、大分子的细胞器。自噬已经成为目前癌症研究领域的热门话题,自噬与肿瘤的关系错综复杂,它具有促进肿瘤生存和死亡的双重作用。ARHI基因是1999年Yu等克隆的一个新的基因,它是一个母源印迹基因。本实验室前期研究工作表明ARHI基因是抑癌基因,并在胰腺癌组织中表达下调,ARHI基因具有抑制胰腺癌细胞系的增殖、诱导调亡、导致细胞周期停滞的作用。国外文献报道在卵巢癌、乳腺癌等多种细胞系中ARHI均具有诱导自噬的作用,本实验室前期瞬时转染ARHI基因可以诱导胰腺癌PANC-1细胞系发生自噬。目前尚无应用稳定转染细胞系研究ARHI诱导自噬的报道。本研究立足于自己构建的稳定转染ARHI基因的胰腺癌PANC-1细胞株,研究ARHI对胰腺癌细胞自噬的影响及可能的分子机制。并在组织学水平初步探讨ARHI与自噬相关蛋白的表达及其相互关系。通过以上研究,寄望为进一步研究胰腺癌发病机制及诱导自噬治疗在胰腺癌中应用的可行性,提供一些重要的理论依据。第一部分ARHI基因诱导胰腺癌PANC-1细胞系自噬作用机制的初探目的：探讨稳定转染ARHI基因是否诱导胰腺癌细胞系PANC-1白噬及可能的分子机制。方法：应用本实验室自己构建的稳定转染ARHI基因的胰腺癌PANC-1细胞系,荧光显微镜验证转染效率,RT-PCR及Western blot验证ARHI基因转录及翻译水平表达情况。采用MTT试验观察ARHI对细胞增殖的影响；Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率。应用吖啶橙染色观察细胞内嗜酸性自噬溶酶体；透射电镜观察细胞内具有双层膜结构的自噬体；Western blot检测ARHI基因对LC3、p62和Beclinl蛋白表达的影响。用RT-PCR的方法检测ARHI对LC3、ULK1、Beclin1、PI3KC3、Atg7、Bcl-2基因表达的影响；Western Blot方法测定ARHI、LC3蛋白含量在稳定转染ARHI细胞中胞浆和胞膜成分中的差异。研究结果：1.稳定转染ARHI的PANC-1细胞可见ARHI基因mRNA及蛋白表达,而空载体组及正常PANC-1细胞组无ARHI mRNA及蛋白表达。2.ARHI可抑制胰腺癌细胞的增殖,从第3天起与空载体组相比有显著差异(P<0.05)；Hoechst33258染色显示ARHI组及空载体组均可见凋亡细胞核及凋亡小体,正常PANC-1细胞未见明显凋亡征象；PI染色流式细胞仪检测凋亡率显示ARHI组细胞凋亡率(4.44±1.96)%,显著高于空载体组(1.92+0.40)%(P<0.05)。3.吖啶橙染色可见ARHI组细胞内亮红色自噬溶酶体,其发生率(27.2%)显著高于空载体组(6.3%)(P<0.05)；透射电镜证实ARHI转染组和空载体组均可见典型自噬体,ARHI组自噬小体数目(4.8±3.0)显著高于空载体(0.8±1.0)；Western blot结果显示,ARHI组的LC3-II蛋白表达显著上调,p62蛋白表达显著下调。4.RT-PCR结果显示,与空载体组相比,ARHI组的ULK-1、Beclin1、PI3KC3、LC3、ATG7基因在mRNA表达水平均无显著变化,而BCL-2基因的mRNA表达与空载体组相比显著下调；Western blot结果显示,ARHI组的Beclinl蛋白表达无显著差异。5. Western blot结果显示ARHI组的胞膜组分中的LC3-Ⅱ和ARHI蛋白表达显著高于胞浆组分。小结：1.多克隆稳定转染ARHI基因可抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,诱导凋亡和自噬。2.稳定转染ARHI的PANC-1细胞株BCL-2mRNA表达水平下调,而LC3、Beclin1、ULK-1、PI3KC3、ATG7基因的mRNA转录水平和Beclinl蛋白的表达与空载体组相比无显著差异。3. LC3-Ⅱ和ARHI蛋白在胞膜组分中的表达显著高于胞浆组分。第二部分ARHI和自噬相关蛋白在胰腺癌组织中的表达情况及其临床病理意义目的：探讨胰腺癌组织自噬水平的变化及ARHI与胰腺癌组织自噬的关系。方法：1.收集39例胰腺癌、10例癌旁组织及11例正常胰腺组织标本,登记临床病理资料。2.应用免疫组化方法测定ARHI、LC3和p62在胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中的表达。3.分析ARHI、LC3和p62的表达与胰腺癌临床病理因素的关系。4.分析ARHI、LC3和p62三者之间的关系。研究结果：1.ARHI在正常胰腺组织、癌旁组织和胰腺癌组织中表达的阳性率分别为100%、80%和35.9%,三组ARHI阳性表达呈下降趋势(X2=39.448,P=0.000)；LC3在正常胰腺组织、胰腺癌组织和癌旁组织中的高表达率分别为27.3%、74.4%和90%,三组LC3的高表达率呈上升趋势(X2=21.280,P=0.020)；p62在正常胰腺组织、癌旁组织和胰腺癌组织中的高表达率分别为45.5%、70%和66.7%,胰腺癌和癌旁组织中p62的表达明显高于正常胰腺组织(X2=14.275,P=0.027)。2.LC3蛋白表达与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、血清CA199水平、临床分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度和肿瘤的位置均无显著相关性；p62蛋白的表达与肿瘤位置呈显著相关性(P=0.049),胰头部肿瘤p62高表达的几率较高,而与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、血清CA199水平、临床分期、肿瘤大小、肿瘤分化程度均无显著相关性；ARHI蛋白的表达与肿瘤分化程度呈显著相关性(P=0.005),肿瘤分化程度越低,ARHI表达缺失的几率越高,而与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、血清CA199水平、临床分期、肿瘤大小、肿瘤位置均无显著相关性。3.ARHI与LC3的表达、ARHI与p62的表达、LC3与p62的表达均无显著相关性(P>0.05)。小结：1. ARHI在胰腺癌中表达缺失或显著下调；LC3和p62在胰腺癌和癌旁组织中表达显著上调。2.p62蛋白的表达与肿瘤位置相关,胰头部肿瘤p62高表达的几率较高；ARHI蛋白的表达与肿瘤分化程度相关,肿瘤分化程度越低,ARHI表达缺失的几率越高。3. ARHI与LC3的表达、ARHI与p62的表达、LC3与p62的表达均无显著相关性。结论：1.ARHI基因可抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,诱导凋亡和自噬。2. ARHI基因诱导PANC-1细胞株自噬和凋亡可能与下调BCL-2基因转录有关。3.在多克隆稳定转染ARHI基因的PANC-1细胞株中,胞膜蛋白成分中的LC3-Ⅱ和ARHI蛋白显著高于胞浆成分,提示ARHI可能直接参与自噬。4. ARHI在胰腺癌组织中表达缺失或下调。5.LC3在胰腺癌组织、癌旁组织中表达上调,提示胰腺癌自噬水平增高。6.p62在胰腺癌组织、癌旁组织中表达上调,提示其可能参与胰腺癌的发生发展。7. ARHI、LC3和p62三者之间在胰腺癌的表达无显著相关性。