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冠状动脉疾病(CAD)一直是威胁人类健康的几大杀手之一,目前最好的治疗手段是在病变部位置入药物洗脱支架(DESs),可一定程度上减少血管再狭窄的几率。但临床结果表明,DESs虽降低了血管再狭窄,却大大延迟了支架内皮化的时间,治疗效果不理想。究其原因,DESs上携带的抗增殖类药物的使用,这类药物多为紫杉醇及其衍生物等,他们大多无细胞特异性,在抑制中膜细胞增殖的同时;也抑制了内膜细胞的增殖,使损伤的内膜未能快速修复。然而这些药物延迟内皮化的详细机理却不清楚,特别是如何延迟内皮细胞快速迁移至损伤位点的机制。基于此,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为细胞模型,体外探究紫杉醇的类似物多西他赛(DTX)对HUVECs的影响及其作用机制,重点关注细胞运动和迁移的经典信号通路ROCK是否参与了DTX相关的HUVECs迁移。试图揭示DTX延迟内皮化的原因,探究快速内皮化潜在靶点,且为DTX的临床应用提供更广泛的理论依据。主要研究结果如下:1 DTX影响HUVECs生物学行为的浓度依赖性:细胞增殖结果表明,中等剂量的DTX(0.5 ng/ml,5 ng/ml)即可显著抑制HUVECs的增殖且具有浓度和时间依赖性;流式细胞仪检测表明,高剂量的DTX(50 ng/ml)出现了明显的细胞毒性,显著促进了细胞的凋亡(包括早期凋亡,晚期凋亡和坏死);细胞粘附结果表明,DTX仅延迟了细胞的粘附时间并未影响其粘附总数;单个HUVECs(活细胞工作站)和群体细胞(划痕法和transwell法)的运动和迁移结果表明,低剂量的DTX(0.05 ng/ml)可显著抑制单个细胞和群体细胞的迁移。表明DTX抑制HUVECs迁移的效应更加敏感。2 DTX影响细胞增殖和的凋亡相关基因的表达:采用免疫荧光和免疫印迹方法分别对反映细胞增殖情况的蛋白PCNA和表征细胞凋亡的蛋白p53的表达水平进行了定性定量分析。研究结果表明:DTX浓度愈高,PCNA的表达越低且p53的表达越高,说明DTX通过促进促凋亡基因p53的表达加速了细胞的凋亡,这种效应在DTX的浓度为50 ng/ml时最为显著。3 DTX抑制HUVECs迁移的机制:DTX显著抑制了黏着斑蛋白Integrinβ1的表达,降低了ROCK信号通路中MLC的磷酸化水平,且在ROCK的抑制剂Y-27632预处理细胞后这种效应愈加显著,还大大降低了细胞的迁移数目。说明DTX可能是通过Integrinβ1-ROCK-(p)MLC信号通路抑制细胞的迁移。4 DTX影响了HUVECs的功能:免疫荧光和免疫印迹定性定量研究表明,中等剂量的DTX(5 ng/ml)显著抑制了HUVECs细胞间粘附因子PECAM-1的表达,表明其在一定程度上减弱了细胞间紧密程度,使得细胞间的粘附力降低。此外,DTX还显著降低了HUVECs分泌NO的能力,表明DTX破坏了血管正常的收缩和舒张。