血栓是导致世界各地发病率和死亡率较高的原因之一。现有溶栓药物虽然能有效溶解血栓,但易引起出血并发症。柞蚕溶茧酶是柞蚕蛹在羽化时分泌的吐出液中的一种酶,这种酶能够能软化茧壳,从而使蚕蛾“脱茧而出”。本实验室已通过实验证明柞蚕溶茧酶具有溶栓活性,并且出血活性小,这为溶栓药物的开发提供了一条新途径。为了研究溶茧酶结构与溶栓活性间的关系,本论文以柞蚕溶茧酶序列为模板,通过同源建模构建溶茧酶的三维结构,寻找柞蚕溶茧酶的底物口袋与活性中心,并通过与模式底物BAEE (Na-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride)的分子对接,预测出可能的活性位点。同源建模及分子对接表明,44位组氨酸,87位天冬氨酸,183位丝氨酸为柞蚕溶茧酶的关键活性位点。采用重叠延伸PCR的方法分别将天然溶茧酶氨基酸序列中的44位氨基酸CAT密码(编码组氨酸H44),87位氨基酸GAT密码(编码天冬氨酸D87)以及183位氨基酸GCG密码(编码丝氨酸S183)定点突变为丙氨酸GCG,然后构建重组表达载体pFastBac-EGFP-GST-Cocoonase及突变表达载体pFastBac-EGFP-GST-Cocoonase-(H44A/D87A/S183A),并利用Bac to Bac昆虫杆状病毒表达系统对柞蚕溶茧酶及其突变体进行表达。通过SDS-PAGE及Western Blot结果显示柞蚕溶茧酶基因及定点突变后的溶茧酶基因均获得成功表达。将表达后的融合蛋白分离纯化,并进行活力测定,在纤维蛋白原降解实验中,突变后的溶茧酶对纤维蛋白原的降解能力变弱；对纤维蛋白的降解实验中,三种突变体均失去了降解纤维蛋白的能力。综合以上实验结果,可以证明柞蚕溶茧酶的活性中心位点为44位组氨酸,87位天冬氨酸,183位丝氨酸,这为进一步研究溶茧酶的溶栓机制奠定基础。